汽爆處理對油茶籽餅粕中茶皂素理化性質的影響

李 恒,鄭曉燕,鄭麗麗,楊 旸,校 導,艾斌凌,潘永貴,盛占武,*

(1.海南大學食品科學與工程學院,海南?？?570228;2.中國熱帶農業(yè)科學院海口實驗站,海南?？?570102;3.海口市香蕉生物學重點實驗室,海南?？?570102)

油茶(Camelliaoleifera Abel)又名茶子樹,屬于山茶(Camellia)科山茶屬山茶亞屬油茶組,是世界四大木本油料植物之一,主要分布于我國長江流域及以南地區(qū),是我國特有的食用油料樹種[1]。油茶籽餅粕作為油茶榨完油后的副產物,含有茶皂素、多糖、蛋白質等多種功能成分,具有較高的利用價值[2]。茶皂素(Tea Saponin)又名茶皂甙,是存在于山茶科植物中的一類齊墩果烷型三萜類皂苷混合物[3],不僅具有天然的表面活性作用,還有抑菌、殺蟲、抗癌等功效[4-7],可應用于飼料、醫(yī)藥和日化等方面[8-10]。

蒸汽爆炸(SE)是目前公認的處理農業(yè)副產物高效、清潔的技術之一,近年來在活性化合物提取中不斷創(chuàng)新[11]。蒸汽爆破技術的原理是將原料置于高溫高壓環(huán)境中,利用過熱飽和蒸汽對物料進行處理,使原料孔隙中充滿蒸汽,然后瞬間釋放高壓,使原料孔隙中的飽和蒸汽急劇膨脹而發(fā)生爆破,原料細胞壁結構被破壞而形成微孔,從而使小分子物質從細胞中釋放出來[12]。魏錦錦等[13]運用汽爆技術使得黃酮和綠原酸的得率從7.63和0.25 mg/g 顯著提高到了26.83 和1.22 mg/g;張棋等[14]運用汽爆技術處理后總黃酮提取量是未經預處理粉葛提取量的2.32倍;靳羽慧等[15]運用汽爆技術預處理后豆渣中黃豆黃苷較汽爆前增高了17.75倍。基于汽爆的原理:采用汽爆預處理結合傳統(tǒng)提取方法勢必可以有效提高茶皂素的提取率,同時改變其理化性質。然而,目前利用汽爆預處理提取皂苷的研究在國內外還鮮有報道。

因此,本研究根據上述文獻報道和前期預實驗結果,選擇汽爆壓力0.9～2.1 MPa和時間30～150 s處理油茶籽餅粕,探明不同預處理條件對茶皂素提取率的影響,并分析汽爆前后對茶皂素理化性質的影響,以期為汽爆技術在茶皂素提取方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶籽餅粕 海南新美特科技有限公司;65%茶皂素 上海綠葉生物科技有限公司;濃硫酸 廣州化學試劑廠;香草醛 國藥集團化學試劑有限公司;乙腈(色譜純) 美國天地公司;所有分離用有機溶劑 均為國產分析純。

QBS-80汽爆試驗臺 河南省鶴壁正道生物能源有限公司;Agilent 1100 & Esquire HCT液相色譜-質譜聯(lián)用儀,配有電噴霧離子源(ESI) 美國安捷倫公司 德國Bruker公司;JSM-7500F掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社;UV-1800紫外-可見分光光度計 島津儀器有限公司;BZY-1自動表面張力儀 上海衡平儀器儀表廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 汽爆預處理 將干燥的油茶籽餅粕放入蒸汽爆破物料腔內,分別于0、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 MPa條件下處理60 s,選出最適壓力并相應處理0、30、60、90、120、150 s,汽爆后收集物料,50 ℃烘干10 h后粉碎,過40目篩備用。

1.2.2 油茶籽餅粕的微觀結構 取干燥樣品1 g粘在帶有導電膠帶的樣品臺上,用離子濺射方法噴金后,用掃描電鏡進行觀測。

1.2.3 茶皂素的提取及純化

1.2.3.1 茶皂素的提取 提取方法參考文獻[17],稱取10 g脫脂茶籽粕置于500 mL錐形瓶中,按料液比為1∶20加入70%乙醇溶液,60 ℃水浴浸提2 h,提取兩次,將得到的兩次提取液合并備用。

1.2.3.2 茶皂素的純化 純化方法參考文獻[18],將上面提取的茶皂素溶液倒入分液漏斗,用正丁醇萃取3次。合并正丁醇層并用旋轉蒸發(fā)儀在溫度35 ℃,轉速70 r/min進行濃縮,將濃縮液按照1∶5的比例倒入丙酮中,得到茶皂素沉淀置于50 ℃真空干燥箱內烘10 h,稱重后裝袋。所有處理3次重復。

1.2.4 茶皂素提取率的計算

1.2.4.1 標準曲線的制作 取65%茶皂素0.1 g,用80%乙醇溶解,定容至50 mL,配成1.3 mg/mL茶皂素標準溶液,充分搖勻后備用。方法參考傅春玲等[16]方法。

取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL標準溶液定容至7.0 mL,分別配成0.0929、0.1857、0.2786、0.3714、0.4643 mg/mL茶皂素標準溶液。分別取0.5 mL稀釋后的標準溶液于10 mL具塞試管中,加入0.5 mL 8%的香草醛溶液后,放置于冰水浴中,加入4 mL 77%的硫酸溶液,充分搖勻,60 ℃加熱15 min后冰水浴10 min,取出至室溫,以試劑空白為對照,在UV-1800紫外-可見分光光度計上550 nm波長處測吸光度(A)。以A為縱坐標,茶皂素質量濃度(mg/mL)為橫坐標,得標準曲線方程:y=0.9053x-0.0387,R2=0.99931。

1.2.4.2 茶皂素的測定及提取率的計算

式中:Y表示茶皂素的提取率,%;C表示樣品溶液的濃度,mg/mL;V表示樣品溶液的體積,mL;n表示樣品溶液稀釋倍數(shù);m表示茶籽粕的質量,mg。

1.2.5 茶皂素表面活性測定 表面張力、起泡性、乳化性的測定均參考李迅[19]的方法。

1.2.5.1 表面張力測定 將1.2 MPa、60 s汽爆條件下提取的茶皂素和對照處理提取的茶皂素分別配制成濃度為0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.1%、0.5%、1%的梯度溶液,用表面張力儀分別測定各個樣品梯度溶液的表面張力值。

1.2.5.2 起泡性的測定 將1.2 MPa、60 s汽爆條件下提取的茶皂素和未汽爆提取的茶皂素分別配制成濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.5%(W/V)的梯度溶液,從中吸取2 mL置于25 mL具塞試管中,上下振蕩30次,測量30 s和5 min時的起泡高度,分別記為A和B。A為起泡能力;B/A為泡沫穩(wěn)定性。

1.2.5.3 乳化性的測定 將1.2 MPa、60 s汽爆條件下提取的茶皂素和未汽爆提取的茶皂素分別配制成1%水溶液作為水相,正己烷作為脂相,分別吸取6 mL水相與脂相于20 mL玻璃瓶中,超聲混合2 min后,分別記錄0、30 min和24 h時乳化層厚度。

1.2.6 紅外光譜分析 茶皂素與溴化鉀1∶100混勻,研缽中研磨10 min,壓制成片,用傅葉變換紅外光譜儀,在500～4000 cm-1區(qū)間進行掃描。

1.2.7 茶皂素單體定性分析鑒定 將汽爆處理提取純化得到的茶皂素用無水甲醇配成濃度1 mg/mL的溶液。使用液相色譜-質譜聯(lián)用技術進行定性分析。

色譜條件為:進樣量1 L,流動相A相:99.9%水+0.01%甲酸,B相:甲醇,洗脫條件為:0～3 min,10% B～35% B,3～12 min,35% B～95% B,12～18 min,95% B。流速0.2 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長200～300 nm。

質譜條件為:離子源:ESI,正負離子同時掃描,質量掃描范圍m/z 1000～1300,加熱模塊溫度250 ℃,CDL溫度200 ℃;霧化氣流速1.5 L/min,干燥氣流速10 L/min,檢測器電壓1.7 kV。

1.3 數(shù)據分析

所有實驗重復三次,用Origin 8.5軟件作圖,采用DPS的單因素方差分析對實驗結果進行差異性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 汽爆壓力對茶皂素提取率的影響

維持壓力時間為60 s,不同汽爆壓力下處理對茶皂素的提取率如圖1所示。在0～1.2 MPa壓力范圍內,隨著汽爆壓力升高,茶皂素的提取率由0 MPa的21.8%增加到1.2 MPa時的30.4%,之后降低到2.1 MPa的23.1%,汽爆壓力為1.2 MPa時茶皂素提取率與其它處理組相比差異顯著(P<0.05)。這可能是由于茶皂素主要分布在餅粕細胞內,汽爆處理過程中介質和內部的蒸汽釋放出強大的沖擊波,破壞了植物多孔介質的基質結構,致使茶皂素等成分溶解和擴散[20]。當蒸汽爆破壓強過高時,茶皂素得率反而會下降,這可能與過高的溫度和壓強使得蛋白質與羰基化合物發(fā)生了美拉德反應,最終生成棕色甚至是棕黑色的大分子物質[21]。從茶皂素提取率和節(jié)能方面考慮,汽爆壓力選擇1.2 MPa較為合理。

圖1 汽爆壓力對茶皂素提取率的影響

2.2 汽爆時間對茶皂素提取率的影響

汽爆處理時間是影響茶皂素提取率的另一個重要因素,圖2表明隨著汽爆時間的延長,茶皂素提取率由0 s時的21.7%增加到60 s時的31.2%,在汽爆時間為60 s時達到最高,隨著汽爆時間的延長,提取率降低到150 s時的26.7%,60 s時的提取率與其它處理組(除30、90 s外)相比差異顯著(P<0.05)。汽爆過程是先加壓使蒸汽進入生物質的纖維組織和細胞內,然后在短時內(0.00875 s)迅速釋放壓力[22]。因此,汽爆處理的時間太短,物料在高溫高壓的環(huán)境下反應不夠充分,餅粕的細胞結構沒有被完全破壞,茶皂素無法有效地釋放出來;作用時間過長則茶皂素可能發(fā)生水解反應而降解[23]。從節(jié)能的角度看汽爆時間選擇60 s更合適,在此條件下茶皂素的提取率為31.2%,汽爆法可以提高茶皂素的提取率,與Sui等[24]研究結果一致。汽爆法提取的茶皂素得率高于微波輔助提取法的12.38%[25],乙醇-超聲波結合法的18.54%[26],可廣泛用于茶皂素的提取?？梢?汽爆預處理提高了茶皂素的提取率。

圖2 汽爆時間對茶皂素提取率的影響

2.3 汽爆處理對茶皂素表面張力的影響

茶皂素的滲透、潤濕、乳化、去污、分散和增溶等作用都是基于其表面活性[27]。表面張力和臨界膠束濃度通常被用來評價表面活性劑的表面活性,表面活性能力與活性劑的使用濃度有關[19]。由圖3可知,汽爆和對照提取的茶皂素水溶液的表面張力值隨著濃度的增加有一個明顯的下降過程,并且最終趨于穩(wěn)定,汽爆組的表面張力為47.63 m/Nm,對照組的表面張力為48.07 m/Nm。汽爆提取的茶皂素臨界膠束濃度值在0.1%左右,對照組在0.5%左右,汽爆提取茶皂素臨界膠束濃度值顯著低于對照組(P<0.05),說明汽爆提取的茶皂素表面活性比對照組高,這可能與汽爆處理提高了茶皂素得率有關。

圖3 汽爆處理對茶皂素表面張力的影響

2.4 汽爆處理對茶皂素起泡性的影響

起泡性能也是茶皂素表面活性的一個重要指標[28]。由圖4可知,靜置30 s時汽爆和對照組茶皂素起泡高度均隨濃度的升高而增加,分別由0.28、0.53 cm增加到5.7、5.4 cm,兩組相比差異不顯著(P>0.05)。研究表明,5 min時茶皂素泡沫高度與30 s時泡沫高度的比值可以衡量泡沫的穩(wěn)定性[28]。由圖5結果可知,隨著茶皂素濃度的增加,汽爆處理組的比值由77%增加到97%,對照組的比值由83%增加到97%,相比之下汽爆處理組比值增加幅度較大。汽爆處理提取的茶皂素起泡穩(wěn)定性比對照組低,可能是汽爆處理過程中對茶皂素的結構造成了影響,部分茶皂素水解所致[19]。當穩(wěn)定性比值超過50%即可定義為相對穩(wěn)定的狀態(tài)[29]。從圖5結果可以看出,盡管汽爆處理提取的茶皂素起泡能力比未汽爆處理的低,但依然具有較好的泡沫穩(wěn)定性。

圖4 不同處理對茶皂素起泡性的影響

圖5 不同處理對茶皂素泡沫穩(wěn)定性的影響

2.5 汽爆處理對茶皂素乳化性的影響

乳化劑是對乳狀液的穩(wěn)定性起重要作用[30]。茶皂素與其他天然乳化劑相比,可在較低的濃度下形成細小油滴,并在多種環(huán)境條件下保持穩(wěn)定[31]。由圖6可知,對照組乳化層在30 min后高度由1.23 cm降到1 cm,而汽爆組乳化層高度由1.33 cm降到1.26 cm,二者相比差異不顯著(P>0.05),但汽爆組變化相對較小。乳化層高度變化越小說明汽爆處理的樣品乳化能力越強,乳化層高度保持時間的長短可衡量乳化穩(wěn)定性,時間越長穩(wěn)定性越好[30]。24 h后汽爆組乳化層高度降到0.6 cm,對照組降到0.47 cm,二者差異不顯著(P>0.05)。因此,汽爆處理對茶皂素的乳化性影響較小。

圖6 不同處理對茶皂素乳化性的影響

2.6 掃描電鏡分析

如圖7所示,汽爆處理的油茶籽餅粕結構與對照組相比發(fā)生了明顯變化。從圖7A可以看到未經處理的油茶籽餅粕結構較為完整,表面相對光滑,組織結構比較致密。而經過汽爆處理后(圖7B)的油茶籽表面層次增加,表面質地疏松,具有很多孔隙立體網狀結構,呈現(xiàn)一定的蜂窩狀,相對表面積增大,有利于茶皂素的釋放。汽爆處理為瞬時高溫高壓過程,可以在極短時間內有效地破壞細胞內部組織和細胞壁,從而在細胞表面形成孔隙,有利于茶皂素的提取。這與汽爆能夠破壞米糠細胞壁屏障,增加米糠蛋白的釋放[32],破壞香菇細胞壁,使香菇體內的多糖、總糖、蛋白質均有所增加的結論是一致的[33]。

圖7 油茶籽餅粕結構掃描電子顯微鏡圖

2.7 FTIR分析

汽爆處理和對照組樣品的FTIR結果如圖8所示,在3000～2700 cm-1附近為飽和C-H的伸縮振動峰,在1750～1600 cm-1附近為C=O的伸縮振動峰,在1460 cm-1處為-CH-的反對稱變形振動峰;1262 cm-1處為C-O-H的面內彎曲振動峰,在1077和1046 cm-1處為C-O-C的伸縮振動峰。可見,兩組樣品與已報道茶皂素的主要特征峰一致[28,34],只是汽爆組在2854 cm-1(C-H對稱伸縮振動峰)、1710 cm-1(C=O的伸縮振動峰)、1174 cm-1(C-O-C的伸縮振動峰)和 838 cm-1(C-H面外彎曲振動)處吸收峰有所增強,這可能與部分茶皂素單體在汽爆過程中發(fā)生水解有關[19]。

圖8 不同處理茶皂素的紅外光譜圖

2.8 茶皂素的液相色譜-質譜聯(lián)用分析結果

預實驗表明茶皂素在陰離子模式下峰形清晰,由此選擇陰離子模式便于后續(xù)分析。利用液質聯(lián)用儀對提取的茶皂素化學組成進行定性分析,結果如圖9所示。從9B圖中可以看出茶皂素主要有三個離子峰,將三個離子峰定位在液相圖9A時,剛好有三個吸收峰即1、2、3,可推測出茶皂素中有三個單體。1、2、3三個組分的質譜圖分別為圖9C、D、E。從陰離子質譜圖中可知,組分1的[M-H]-為1097.2138,可知分子量為1097,推測其分子式可能為C54H82O23,與Morikawa等[35]結果對比,推測組分1可能為茶皂素E13。組分2的[M-H]-為1231.5456,可知分子量為1231,推測其分子式可能為C59H91O26,與Fu等[36]研究結果一致,皂素2可能為油茶皂苷D5。組分3的[M-H]-為1189.5455,可知分子量為1189,推測其分子式可能為C57H89O26,由Morikawa等[37]和Yoshikawa等[38]的研究結果可知,皂素3可能為茶皂素B5或C1。由于本研究未做核磁共振分析,茶皂素精確結構有待于下一步研究確定。

圖9 茶皂素化學組成的液質聯(lián)用儀分析結果

3 結論

汽爆預處理明顯提高了油茶籽餅粕中茶皂素的提取率和表面活性,降低了茶皂素的表面張力和起泡性,汽爆處理對茶皂素乳化性影響較小。掃描電鏡結果表明,汽爆處理使茶籽粕的表面變得粗糙疏松,油茶籽餅粕微觀結構遭到破壞,有利于茶皂素從細胞中釋放出來,進而縮短了茶皂素的提取時間,提高了茶皂素的得率。FTIR結果表明,汽爆處理的茶皂素部分峰形出現(xiàn)了增強現(xiàn)象,表明汽爆處理對茶皂素結構會產生影響。液質結果顯示,茶皂素含有3種單體,對比已報道數(shù)據推測其可能是茶皂素E13、油茶皂苷D5、茶皂素B5或茶皂素C1。因此,汽爆預處理油茶籽粕可明顯提高茶皂素的提取率,改變茶皂素的部分理化性質。