椎間盤造影中碘海醇劑量對大鼠椎間盤退行性變的影響

王偉恒，孫子杰，黃曉東，孟慶溪，葉曉健

1.海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003

2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第904醫(yī)院骨科，無錫 214000

3.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科，廣州 440104

4.中國人民解放軍第960醫(yī)院骨科，濟南 250000

椎間盤造影術是將造影劑注入椎間盤，利用影像學手段觀察椎間盤的形態(tài)，反映椎間盤的病理特征［1］。作為一種侵入性的有創(chuàng)診斷技術，椎間盤造影術一直存在爭議［2］。然而，椎間盤造影術具有不可替代的優(yōu)勢，如典型的疼痛復制、直觀地顯示椎間盤損傷程度等［3］，其臨床應用仍十分廣泛。近年來，椎間盤造影對椎間盤退行性變的影響倍受重視。臨床研究表明，椎間盤造影可加速腰椎椎間盤退行性變的進展［4］。體內研究表明，椎間盤造影和椎間盤阻滯可顯著增加椎間盤內細胞的凋亡［5］。體外細胞實驗表明，局部麻醉藥和非離子型造影劑對纖維環(huán)細胞和髓核細胞均有不利影響［6］。目前關于椎間盤造影術中注射造影劑劑量及注射速度仍沒有明確的標準，且存在很大爭議［7-9］，本研究通過觀察椎間盤造影過程中造影劑劑量對大鼠尾椎椎間盤退行性變的影響，為評估椎間盤造影術的臨床價值和風險提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10只3月齡雄性SD大鼠（海軍軍醫(yī)大學動物實驗中心提供），體質量（350±50）g。選擇3月齡的雄性SD大鼠是因為此時大鼠骨骼趨于成熟，以盡量減少年齡增長引起的實驗誤差［10］。每籠2只分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（25±1）℃，12 h/12 h晝夜循環(huán)，自由飲食，實驗前適應環(huán)境至少1周。所有動物實驗均通過海軍軍醫(yī)大學實驗動物倫理委員會審批備案。

1.2 模型建立

正常成人椎間盤內髓核容積約為3 mL，而臨床中使用的常規(guī)椎間盤內注射劑量為2 mL。成年大鼠尾椎椎間盤的平均椎間盤高度為0.94 mm，髓核面積為3.30 mm2，總髓核體積為3.10 mm3［11］。因此，本研究選擇2 μL模擬臨床椎間盤造影中的常規(guī)注射劑量，選擇3 μL即大鼠尾椎椎間盤的極限容積作為高劑量。

將實驗大鼠用10%的水合氯醛以30 mL/kg的劑量麻醉。選取尾部4個椎間盤為研究對象：Co6/Co7為空白組，不行任何處理；Co7/Co8為對照組，以30號穿刺針刺入椎間盤但不進行注射；Co8/Co9為常規(guī)劑量組，以30號穿刺針注入2 μL碘海醇（歐乃派克，含碘質量濃度300 mg I/mL，質量滲透摩爾量為780 mOsm/kg，上海通用電氣藥業(yè)有限公司）；Co9/Co10為高劑量組，以30號穿刺針注入3 μL碘海醇。所有穿刺操作均在X線引導下完成，穿刺針方向平行于所選椎間隙的上下終板，以醫(yī)用止血鉗控制進入椎間盤的導針長度為5 mm（圖1a、b）。碘海醇的注入使用3 μL微量注射器（Hamilton，瑞士），注射完畢后將導針滯留于椎間盤內2 min以防止液體滲漏。

1.3 X線檢查

椎間盤造影后2周及4周，使用X線檢測椎間盤高度指數(shù)（DHI）的變化。將大鼠用濃度10%的水合氯醛以30 mL/kg的劑量經(jīng)腹部注射麻醉，使大鼠尾部肌肉松弛以便觀察。使用X線拍攝大鼠尾椎椎間盤高度。采用Han等［12］提出的方法測量DHI，即DHI（%）=2×（D+E+F）/（A+B+C+G+H+I）×100%，其中A、B、C分別為上位椎體前緣、中點和后緣的高度，D、E、F分別為椎間隙前緣、中點和后緣的高度，G、H、I分別為下位椎體前緣、中點和后緣的高度（圖1c）。所有圖像均由2名對樣本不知情的獨立觀察者測量。通過Sante DICOM Viewer FREE圖像軟件分析DHI的變化。

1.4 MRI檢查

椎間盤造影后2周及4周使用MRI對大鼠尾椎椎間盤信號進行檢測。將大鼠用10%水合氯醛以30 mL/kg的劑量麻醉，使尾部肌肉松弛以便觀察。采用3.0 T小動物MRI機（飛利浦，荷蘭）對椎間盤進行薄層掃描，以T2加權像評估椎間盤信號改變情況［13］。所有測量均由2名醫(yī)師各自獨立進行，不同時間段椎間盤信號強度變化應用NIH Image軟件進行分析。

圖1 X線引導下椎間盤造影及DHI測量Fig. 1 Discography guided by roentogenography and DHI measurement

1.5 椎間盤含水量的測定

椎間盤造影4周后，隨機取5只大鼠，將大鼠腹腔注射高濃度水合氯醛麻醉處死，分離椎間盤與周圍軟組織，然后迅速置于-20℃液氮中冷凍。10 min后取出冷凍的椎間盤，使用精度為0.01 mg的電子秤稱得其濕質量（WW）。再將椎間盤置于65℃烘箱中脫水24 h，用同一臺電子秤稱得其干質量（DW）。每次稱量均重復3次，取平均值。椎間盤含水量（%）=（WW-DW）/WW×100%。

1.6 組織學檢查

影像學數(shù)據(jù)采集完畢后，將另外5只大鼠腹腔注射高濃度水合氯醛麻醉處死，迅速取出Co6/Co7/Co8/Co9/Co10椎間盤組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，用無菌蒸餾水沖洗后放入EDTA中脫鈣48 h，經(jīng)不同梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿平行于椎間盤軟骨排列的方向進行5 μm連續(xù)切片，進行HE染色。使用HE組織學評分評估椎間盤退行性變的程度［14］。椎間盤退行性變組織學評分為0～6分。纖維環(huán)評分：0分，纖維環(huán)結構完整、無破損；1分，纖維環(huán)結構有破損，但小于整體纖維環(huán)的30%；2分，纖維環(huán)結構有破損，且大于整體纖維環(huán)的30%；3分，纖維環(huán)完全破損。髓核評分：0分，有典型的含有大空泡狀結構的髓核細胞散在分布；1分，髓核細胞數(shù)量下降低于總細胞數(shù)的50%，存在或不存在細胞集聚；2分，髓核細胞數(shù)量中度至嚴重（＞50%）下降，且增殖性結締組織占據(jù)小于50%總面積；3分，髓核中增殖性結締組織占據(jù)大于50%總面積。

1.7 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，并使用Graphpad Prism 5軟件作圖。數(shù)據(jù)采用表示，使用單因素方差分析比較組間差異，多重比較采用Student-Newman-Keuls檢驗；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 造影劑劑量對椎間盤DHI的影響

術后2周和4周時，與空白組相比，對照組DHI未見明顯變化，常規(guī)劑量組和高劑量組DHI降低，且高劑量組比常規(guī)劑量組降低更為顯著，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖2）。

圖2 X線檢測造影劑劑量對椎間盤DHI的影響Fig. 2 Effect of contrast agent dose on DHI of intervertebral disc detected by roentgenography

2.2 造影劑劑量對椎間盤信號改變的影響

術后2周和4周時MRI檢測示，與空白組相比，對照組、常規(guī)劑量組和高劑量組椎間盤信號均降低，且劑量越大信號越低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖3）。

圖3 MRI檢測造影劑劑量對椎間盤信號強度的影響Fig. 3 Effect of contrast agent dose on signal intensity of intervertebral disc detected by MRI

2.3 造影劑劑量對椎間盤含水量的影響

椎間盤造影術后4周，與空白組相比，對照組椎間盤含水量未見明顯變化，常規(guī)劑量組和高劑量組椎間盤含水量降低，且高劑量組降低更為顯著，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖4）。

圖4 造影劑劑量對椎間盤含水量的影響Fig. 4 Effect of contrast agent dose on water content of intervertebral disc

2.4 造影劑劑量對椎間盤組織學評分的影響

椎間盤造影術后4周，通過HE染色檢測椎間盤組織學變化（圖5）。結果顯示，空白組和對照組未見明顯組織病理學改變，而常規(guī)劑量組和高劑量組椎間盤組織病理學改變明顯，纖維環(huán)結構有破損，髓核細胞數(shù)量減少。病理組織學評分結果顯示，常規(guī)劑量組和高劑量組椎間盤病理組織學評分高于空白組，且高劑量組病理組織學評分高于常規(guī)劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖6）。

圖5 HE染色Fig. 5 HE staining

圖6 造影劑劑量對椎間盤組織學評分的影響Fig. 6 Effect of contrast agent dose on histological score of intervertebral disc

3 討 論

根據(jù)分子結構分類，造影劑可分為離子型和非離子型。離子型造影劑因其不良反應發(fā)生率高、肌體耐受性差而逐漸被非離子型造影劑所取代。非離子型造影劑也有一定的毒性，不同種類的非離子造影劑的細胞毒性不盡相同，可能與造影劑的滲透壓和黏度相關［6，15-17］。碘海醇屬于第二代非離子型造影劑，目前在臨床上應用最為廣泛，也是臨床椎間盤造影常用的造影劑［18］。體外細胞研究表明，碘海醇具有一定的細胞毒性［19］。本研究在大鼠體內就造影劑劑量對椎間盤退行性變的影響進行研究，于造影術后2周和4周分別對椎間盤的退行性變程度進行評估，評價指標包括DHI、MRI信號強度、椎間盤含水量和椎間盤組織學改變，證明了椎間盤造影中造影劑劑量對椎間盤退行性變的影響，為評估臨床椎間盤造影技術的價值和風險提供了實驗依據(jù)。

本研究證明，在動物體內碘海醇可以引起椎間盤退行性變，并且注射劑量越大，椎間盤退行性變越明顯。椎間盤是人體最大的無血管組織，通過被動擴散完成營養(yǎng)和物質更新，椎間盤內存在特殊的高滲環(huán)境（430 ～ 496 mOsm/kg）［20-21］。本研究使用的碘海醇為上海通用電氣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，規(guī)格為300 mg I/mL，滲透壓為780 mOsm/kg，明顯高于椎間盤的滲透壓。且由于椎間盤是無血管器官，注射的碘海醇可以較長時間殘存在椎間盤內，隨著碘海醇注入量的增加，其對椎間盤的影響也較大。椎間盤退行性變的程度還和椎間盤的靜水壓有關。體內外研究已經(jīng)清楚地表明，靜水壓可以顯著影響細胞外基質成分、細胞合成代謝蛋白的活力和基因的表達［22-25］。碘海醇劑量對椎間盤退行性變的影響可能包括兩方面原因：①在密閉的椎間盤內注射碘海醇體積越大，密閉椎間盤的靜水壓越高，導致椎間盤退行性變的程度越高；②碘海醇為高滲液體且具有細胞毒性，注射體積越大，高滲且有細胞毒性的溶液的量越大，椎間盤的退行性變程度也越大。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，僅進行穿刺針刺入而不進行注射的對照組MRI椎間盤信號也較未進行任何處理的空白組降低，說明針刺本身也可導致椎間盤退行性變。

本研究的不足之處包括以下幾點。①僅從造影劑的劑量角度探討椎間盤造影對椎間盤退行性變的影響，還有其他造成椎間盤退行性變的因素需要考慮，如穿刺針的直徑、椎間盤尺寸（纖維環(huán)的厚度）、操作者的技術熟練程度、實驗動物的營養(yǎng)狀態(tài)及其他未知因素［26-27］。②研究對象為正常大鼠尾椎椎間盤，未研究椎間盤造影術對已經(jīng)發(fā)生退行性變的椎間盤的影響，這和臨床中椎間盤造影術的應用有所差異。主要基于兩方面考慮：一方面，臨床標準的椎間盤造影診斷技術需要1 ～ 2個鄰近節(jié)段的椎間盤造影作為陰性對照，研究椎間盤造影術對正常椎間盤的影響可有效評估陰性對照的價值和風險；另一方面，考慮到椎間盤退行性變造模時，為避免模型的退行性變基線不盡相同造成系統(tǒng)誤差，故使用正常椎間盤。③以大鼠椎間盤作為研究對象，大鼠尾椎椎間盤退行性變造模技術成熟，操作簡便，安全性高，可重復性強，但大鼠椎間盤結構及髓核細胞形態(tài)、生理功能和人體有差異，且大鼠椎間盤內的滲透壓和人體不盡相同，因此，碘海醇造成的大鼠椎間盤退行性變和人體實際情況存在差異。但因倫理等實際操作問題，本研究未將人體作為研究對象。造影劑劑量對人椎間盤退行性變的影響有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，造影劑可引發(fā)椎間盤退行性變，且劑量越大，椎間盤退行性變的程度越高。因此，在進行椎間盤造影時，應當充分考慮造影劑劑量對椎間盤的影響，盡量減少造影劑的使用量，以使其對椎間盤的影響最小化。