飛燕草素對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解的影響

李 桃,鄧媛綠,徐嘉琦,文 湘,楊元香,李佳欣,韓 彬,彭曉莉

(成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,四川成都 610500)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1]。研究發(fā)現(xiàn),黃酮類化合物是植物性食物中主要的功效成分,對(duì)乳腺癌具有積極的防治作用[2-4]?；ㄇ嗨厥且环N常見(jiàn)的黃酮類化合物,共有6種單體,飛燕草素是花青素中常見(jiàn)的一種單體,屬黃酮類化合物,常存在于黑米、葡萄等深色食物中。研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素具有抗腫瘤、抗心血管疾病等多種生物學(xué)活性[5-8]?；ㄇ嗨鼗瘜W(xué)結(jié)構(gòu)中B環(huán)上的鄰二苯酚結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮抑癌效應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),飛燕草素B環(huán)羥基數(shù)量較其它花青素單體多,是花青素中具有顯著生物學(xué)效應(yīng)的單體[9]。飛燕草素能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移[10-12]。

研究發(fā)現(xiàn)富含花青素的草莓提取物能抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解[13]。含飛燕草素的馬奇果提取物具有調(diào)節(jié)糖代謝的作用[14]。糖酵解是腫瘤細(xì)胞能量代謝重要特征,腫瘤細(xì)胞在供氧充足條件下也會(huì)選擇糖酵解途徑作為主要產(chǎn)能方式[15]。葡萄糖通過(guò)細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸,后者在乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)作用下轉(zhuǎn)化成乳酸和ATP[16]。腫瘤細(xì)胞中大約有50%的ATP是通過(guò)糖酵解途徑合成。葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成乳酸的過(guò)程中,己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase-A,LDHA)和M2-型丙酮酸激酶2(Pyruvatekinase type M2 pyruvatekinase,PKM2)等關(guān)鍵代謝酶在腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解中發(fā)揮重要作用[20]。蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)通路整合了生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)信號(hào)和能量代謝信號(hào)通路,與腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解關(guān)系密切[17]。

三陰性乳腺癌占所有乳腺癌的10%～20%,由于缺少雌激素受體、孕酮受體及表皮生長(zhǎng)因子受體,靶向治療此類乳腺癌的難度較高[18-19]。與其他類型的乳腺癌相比,三陰性乳腺癌在治療第一年后表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲能力和高復(fù)發(fā)率[20-21]。本研究利用飛燕草素作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,檢測(cè)飛燕草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞攝取葡萄糖、乳酸生成、ATP水平和HK活性的影響,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)飛燕草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞糖代謝相關(guān)酶蛋白、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)的影響,從糖代謝角度初步探討飛燕草素通過(guò)抑制糖代謝進(jìn)而發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);飛燕草素(純度,≥95%) 美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司;胎牛血清 德國(guó)Millipore公司;BCA蛋白定量試劑盒 美國(guó)Termo公司;抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司;ATP、葡萄糖和乳酸測(cè)定試劑盒 南京建成生物技術(shù)有限公司。

IX71型倒置熒光相差顯微鏡 日本Olympus公司;Biofuge stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、ND-2000微量紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司;ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 對(duì)數(shù)期細(xì)胞用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞稀釋至8×104cell/mL,接種于96孔板,24 h后,加入0、5、10、20、40、80 μmol/L飛燕草素共6個(gè)濃度,每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。DMSO作為溶劑對(duì)照。不同濃度的飛燕草素作用48 h后,吸棄原培養(yǎng)基,加入含10% CCK-8的新培養(yǎng)基100 μL/孔,37 ℃ 孵育2 h,酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度,記錄OD值。計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=(OD試驗(yàn)孔-OD空白孔)/(OD對(duì)照孔-OD空白孔)×100

1.2.3 細(xì)胞Ki67免疫組化染色 細(xì)胞固定后,進(jìn)行免疫組化染色,辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒進(jìn)行顯色處理,用PBS緩沖液作為陰性對(duì)照,免疫組化染色后以細(xì)胞核呈中等強(qiáng)度棕黃色判定為陽(yáng)性細(xì)胞,對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),以陽(yáng)性細(xì)胞在一個(gè)視野中同類型細(xì)胞中的百分比表示陽(yáng)性率,每組選五個(gè)視野計(jì)算平均值。

1.2.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 對(duì)數(shù)期的MDA-MB-231細(xì)胞以1×105cell/mL密度接種于12孔培養(yǎng)板。細(xì)胞生長(zhǎng)至75%密度,分別以0、20、40 μmol/L飛燕草素作用細(xì)胞,24 h后用20 μL槍頭沿線垂直劃痕,PBS沖洗除去懸浮細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基,在實(shí)驗(yàn)0、24 h拍照,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取5個(gè)視野。計(jì)算遷移率。

遷移率(%)=(劃痕后測(cè)得的劃痕面-劃痕后某時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的無(wú)細(xì)胞區(qū)域面積)/劃痕后測(cè)得的劃痕面積×100

1.2.5 細(xì)胞葡萄糖攝取量檢測(cè) 葡萄糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中葡萄糖含量。每個(gè)樣設(shè)3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)空白管和標(biāo)準(zhǔn)管,波長(zhǎng)505 nm處比色,空白管調(diào)零,讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測(cè)定管吸光度。

1.2.6 乳酸生成量檢測(cè) 乳酸酶法檢測(cè)細(xì)胞乳酸濃度。乳腺癌細(xì)胞消化后以 3×104cell/孔的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板,飛燕草素作用細(xì)胞12、24 h后,按說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定。吸取培養(yǎng)液,離心后取0.02 mL上清,加入酶工作液,顯色劑,37 ℃水浴后,加入終止液終止反應(yīng),530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管。

乳酸濃度(mmol/L)=(測(cè)定OD值-空白OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

1.2.7 細(xì)胞ATP濃度測(cè)定 乳腺癌細(xì)胞消化后以3×104cell/孔的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板,飛燕草素作用細(xì)胞12、24 h后,胰酶消化,測(cè)定待測(cè)樣本的蛋白濃度。細(xì)胞ATP 濃度按說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定在636 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值。

ATP濃度(μmol/g)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本稀釋倍數(shù)/待測(cè)樣本蛋白濃度。

1.2.8 HK活性的檢測(cè) 乳腺癌細(xì)胞消化后以3×104cell/孔的細(xì)胞數(shù)接種于24孔板,飛燕草素作用細(xì)胞12、24 h后,胰酶消化,測(cè)定待測(cè)樣本的蛋白濃度。按HK活性試劑盒說(shuō)明書(shū)加入試劑,加入樣本的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),充分混勻,移至比色皿中,記錄30 s時(shí)340 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A1),然后將比色皿中的反應(yīng)液倒入預(yù)先編號(hào)的原試管中,放入37 ℃浴箱中準(zhǔn)確水浴15 min,取出試管測(cè)定15.5 min時(shí)的吸光度(A2)。HK活性的計(jì)算公式為:

HK(U/gprot)=1286×ΔA/Cpr

式中:ΔA表示A2-A1;Cpr表示樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。

1.2.9 Western blot(WB)檢測(cè)蛋白表達(dá) 飛燕草素作用細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞,提取胞漿總蛋白,測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;調(diào)節(jié)樣品濃度,保證每個(gè)樣品上樣量為35 g;采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離,轉(zhuǎn)膜,抗體孵育過(guò)夜;二抗孵育后,化學(xué)試劑顯色發(fā)光,采用多功能成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 飛燕草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率和Ki67表達(dá)的影響

圖2可知,20、40、80 μmol/L飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞,能顯著降低細(xì)胞存活率。20和40 μmol/L飛燕草素能分別降低細(xì)胞存活率至75%和72%(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,飛燕草素能有效抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖。

圖2 飛燕草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

Ki67是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。結(jié)合細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果,去除5和80 μmol/L的劑量,采用0、10、20、40 μmol/L飛燕草素處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,免疫組化檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞Ki67的表達(dá)。如圖3所示,乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或黃褐色沉淀物,為Ki67陽(yáng)性細(xì)胞。乳腺癌細(xì)胞Ki67蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為94%,20 μmol/L飛燕草素處理組Ki67陽(yáng)性率為55%,40 μmol/L飛燕草素處理組Ki67陽(yáng)性率為52%。20、40 μmol/L飛燕草素能明顯降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Ki67表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 飛燕草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Ki67表達(dá)的影響(10×)

2.2 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力,遷移率越高,說(shuō)明細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)采用0、10、20 μmol/L飛燕草素分別作用MDA-MB-231細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與0、10 μmol/L飛燕草素相比,20 μmol/L飛燕草素對(duì)細(xì)胞遷移率有抑制作用。因此,實(shí)驗(yàn)采用0、20、40 μmol/L飛燕草素,檢測(cè)飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響。0、20、40 μmol/L飛燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,24 h時(shí)遷移情況如圖4所示。24 h時(shí)0、20、40 μmol/L飛燕草素作用的乳腺癌細(xì)胞遷移率分別為85%、64%和21%。與0、20 μmol/L飛燕草素組相比,40 μmol/L飛燕草素24 h時(shí)能明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明飛燕草素能顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力。

圖4 飛燕草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響

2.3 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用0、10、20、40 μmol/L飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞12 h和24 h,檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度,計(jì)算細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量。由圖5可見(jiàn),飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞12 h,細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度沒(méi)有顯著差異;飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后,與0 μmol/L飛燕草素相比,20、40 μmol/L飛燕草素能顯著降低細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,飛燕草素能降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。

圖5 飛燕草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231葡萄糖攝取的影響

2.4 飛燕草素對(duì)乳乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞乳酸生成的影響

飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞12和24 h后,檢測(cè)培養(yǎng)液中的乳酸生成水平。由圖6可見(jiàn),不同濃度的飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞12 h,細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸水平?jīng)]有顯著差異;飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h,與0 μmol/L 對(duì)照組相比,40 μmol/L飛燕草素能極顯著降低細(xì)胞乳酸生成水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,飛燕草素能降低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231乳酸的生成。

圖6 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞乳酸生成的影響

2.5 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞ATP濃度的影響

飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞12和24 h后,檢測(cè)細(xì)胞ATP的水平。由圖7可見(jiàn),飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞12 h,與0 μmol/L對(duì)照組相比,40 μmol/L飛燕草素能顯著降低細(xì)胞ATP水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h,20和40 μmol/L飛燕草素能顯著降低細(xì)胞ATP生成,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,飛燕草素能降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞ATP生成的水平。

圖7 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞ATP濃度的影響

2.6 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞HK活性的影響

飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞12和24 h后,檢測(cè)HK活性。由圖8可見(jiàn),不同濃度的飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞12 h,細(xì)胞HK活性沒(méi)有顯著差異;飛燕草素作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h,20和40 μmol/L飛燕草素能極顯著降低細(xì)胞己糖激酶活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,飛燕草素能降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞HK活性。

圖8 飛燕草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 HK活性的影響

2.7 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖代謝相關(guān)酶蛋白表達(dá)的影響

飛燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24 h后檢測(cè)飛燕草素對(duì)PKM2、LDHA 和HK蛋白表達(dá)的影響。由WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖9)可見(jiàn),40 μmol/L飛燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,能顯著降低細(xì)胞PKM2、LDHA和HK蛋白表達(dá)蛋白表達(dá)水平。

圖9 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖代謝相關(guān)酶蛋白表達(dá)的影響

2.8 飛燕草素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Akt/mTOR通路的影響

飛燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24 h后檢測(cè)飛燕草素對(duì)Akt/mTOR通路的p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)的影響。由WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖10)可見(jiàn),40 μmol/L飛燕草素作用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,能顯著降低細(xì)胞p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平。

圖1 飛燕草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖10 飛燕草素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 Akt/mTOR通路的影響

3 結(jié)論與討論

乳腺癌細(xì)胞通過(guò)強(qiáng)化糖酵解功能,大量快速的生成ATP,以適應(yīng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的需要,抑制糖酵解能夠抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和增殖[22]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的活性,降低乳腺癌細(xì)胞遷移能力,進(jìn)一步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,并降低乳酸生成,降低細(xì)胞ATP水平。結(jié)果提示飛燕草素能影響乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用。

PKM2、LDH和HK的水平是評(píng)價(jià)糖酵解活性的重要標(biāo)準(zhǔn)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素可明顯抑制PKM2、LDHA和HK蛋白表達(dá),表明飛燕草素具有抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231糖酵解的效應(yīng)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)飛燕草素能降低p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平,證實(shí)飛燕草素具有抑制Akt/mTOR通路的作用。Akt/mTOR的活化在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用,mTOR能控制和促進(jìn)有氧糖酵解關(guān)鍵酶PKM2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[24-25]。飛燕草素是否能通過(guò)Akt/mTOR通路調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231糖酵解,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)飛燕草素能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)葡萄糖利用,抑制糖酵解相關(guān)酶蛋白的表達(dá),飛燕草素可能通過(guò)Akt/mTOR通路制糖酵解,其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。