黏液型銅綠假單胞菌刺激淋巴細胞過度產(chǎn)生IL-6與難愈性感染的潛在聯(lián)系

宋立?劉鵬?宋明強?薄金雙?張榮明

【摘要】目的 評價非黏液型銅綠假單胞菌與黏液型銅綠假單胞菌刺激淋巴細胞分泌相關細胞因子IL-6的差異。方法 培養(yǎng)2種類型的銅綠假單胞菌，采用革蘭染色后觀察細菌形態(tài)，用質譜分析鑒定菌型，將所獲的非黏液型銅綠假單胞菌與黏液型銅綠假單胞菌菌株分別與淋巴細胞共培養(yǎng)，分別設為非黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細胞組與黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細胞組，再設加入磷酸鹽緩沖液（PBS）組為對照組，即PBS+淋巴細胞組。采用流式法分析觀察淋巴細胞、中性粒細胞于6、24、48 h細胞因子分泌情況。結果 培養(yǎng)所得的非黏液型銅綠假單胞菌與黏液型銅綠假單胞菌細菌形態(tài)完好;非黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細胞組及PBS+淋巴細胞組的上清液中幾乎檢測不到IL-6，而黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細胞組可見大量IL-6分泌（P < 0.05）;相對于PBS+淋巴細胞組，非黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細胞組與黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細胞組均可分泌TNF-α，組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。結論 黏液型銅綠假單胞菌刺激了淋巴細胞分泌大量的炎性因子IL-6，非黏液型銅綠假單胞菌無此特點;基于IL-6具有促進該類細菌增殖的特性，這可能是臨床上黏液型銅綠假單胞菌感染難愈性的一個潛在機制。

【關鍵詞】銅綠假單胞菌;白介素-6;腫瘤壞死因子α;難愈性感染

Potential association between mucoid Pseudomonas aeruginosa-stimulated excessive serection of IL-6 by lymphocytes and chronic refractory infection Song Li， Liu Peng， Song Mingqiang， Bo Jinshuang， Zhang Rongming. Department of Burn and Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， China

Corresponding author，Zhang Rongming， E-mail： zrm99999@126.com

【Abstract】Objective To evaluate the differences of IL-6 secreted by lymphocytes stimulated by mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa. Methods Two types of Pseudomonas aeruginosa were cultured. The morphology of the bacteria was observed by Gram staining.The bacterial type was identified by Mass spectrometry. The mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa strains were co-cultured with lymphocytes and assigned into the mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa+lymphocyte and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa+lymphocyte groups. Phosphate buffer solution （PBS） was used in the control group （PBS+lymphocyte group）. The cytokine secretion of lymphocytes and neutrophils was observed at 6 h， 24 h and 48 h was observed by flow cytometry. Results The mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa strains were observed in intact morphology. Almost no or only a slight amount of IL-6 production was noted in the non-mucoid Pseudomonas aeruginosa+ lymphocyte group and PBS+ lymphocyte group， whereas a large quantity of IL-6 was observed in the mucoid Pseudomonas aeruginosa+ lymphocyte group （both P < 0.05）. Compared with the PBS+ lymphocyte group， TNF-αwas secreted in the other two groups. No significant difference was seen between two groups （P > 0.05）. Conclusions Mucoid Pseudomonas aeruginosa rather than non-mucoid Pseudomonas aeruginosa can stimulate excessive secretion of IL-6 by lymphocytes， which may be a specific mechanism underlying the chronic refractory infection of mucoid Pseudomonas aeruginosa based on the fact that excessive IL-6 can promote the proliferation of this type of bacteria.

【Key words】Pseudomonas aeruginosa;Interleukin-6;Tumor necrosis factor-ɑ;

Chronic refractory infection

銅綠假單胞菌是一類極易引起醫(yī)院感染尤其是ICU獲得性感染并造成不良臨床結局的常見致病菌之一[1-3]。銅綠假單胞菌可分為非黏液型和黏液型。該菌具備固有形成細菌生物膜的特性，可通過生物膜逃避宿主的免疫殺傷及抗菌藥物的作用，是極易引起難愈性感染的重要病原菌[4-5]。除此之外，細菌感染還能夠刺激機體細胞分泌大量炎性因子，諸如IL-6、TNF-α、IL-1β等，有研究表明，某些炎性因子如IL-6，雖然在感染早期適量分泌有益于控制感染，但在感染后期高濃度的IL-6又可促進銅綠假單胞菌的生長[6-7]。一旦達到級聯(lián)式瀑布樣釋放則可導致炎癥反應失控，造成臨床慢性遷延性重癥感染。此前，我們曾研究了在感染早期作為抗感染前沿防線的中性粒細胞與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)后炎性因子的分泌情況，發(fā)現(xiàn)其僅能分泌低量的IL-6（< 100 pg/ml），此濃度不足以刺激銅綠假單胞菌的增殖生長。為此我們考慮，在感染后期中性粒細胞數(shù)目下降，參與特異性免疫反應的淋巴細胞、單核-巨噬細胞是否會通過IL-6調控免疫反應及促進銅綠假單胞菌的增殖生長？在此過程中是全部菌型還是某個菌型更為重要？為解答這個問題，我們開展了此項實驗研究，意在揭示淋巴細胞、單核-巨噬細胞是否通過IL-6參與對黏液型銅綠假單胞菌的免疫反應。

材料與方法

一、實驗菌株

非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌菌株均由山東省威海市立醫(yī)院中心實驗室提供。非黏液型銅綠假單胞菌為ATCC27853，黏液型銅綠假單胞菌來自我院燒傷病例感染創(chuàng)面標本。

二、主要儀器與試劑

高速離心機[北京白洋（BYG20）];二氧化碳培養(yǎng)箱[美國ThermoFisher 公司（150i）];倒置熒光顯微鏡[日本尼康（Nikon Ti-S）];質譜儀[德國布魯克公司 MALDI BIOTYPER];流式細胞儀（AriaⅡ）[美國BD公司];人Th1/Th2/Th17試劑盒購[美國BD公司];1640培養(yǎng)液[美國Gibco公司]，胎牛血清[美國HyClone公司]。

三、方 法

1.銅綠假單胞菌培養(yǎng)與鏡檢

將非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌用劃線法接種于哥倫比亞血瓊脂平板上培養(yǎng)，待菌落形成后，取清潔、干燥載玻片，加一滴無菌生理鹽水于玻片，用接種環(huán)挑取哥倫比亞血瓊脂平板上非黏液型銅綠假單胞菌菌落于載玻片上進行涂片固定;采用貝索快速革蘭染色液進行革蘭染色，再用龍膽紫液染色10 s后水洗甩干;用碘溶液染色10 s后水洗甩干，用脫色液脫色10 ～ 20 s后水洗甩干，用沙黃溶液復染10 s后水洗，用吸水紙吸干水分，于鏡下觀察制備好的非黏液型銅綠假單胞菌。采用同樣方法制備黏液型銅綠假單胞菌，染色后于鏡下觀察。

2.細菌質譜鑒定

用無菌接種環(huán)在生物安全柜中挑取哥倫比亞血瓊脂平板上單個非黏液型銅綠假單胞菌菌落于質譜板中涂勻，干燥后加70%甲酸1 μl， 于37℃烘箱晾干，加入質譜基質1 μl，采用質譜儀進行菌種鑒定。用同樣方法處理黏液型銅綠假單胞菌。

3.檢測標本的制備

取成人健康志愿者外周血10 ml，采用密度梯

度離心法分離淋巴細胞;將淋巴細胞按1.0×106個/孔

的密度接種于6孔板，在孵箱（37℃，5%二氧化碳）中培養(yǎng)2 h。取新培養(yǎng)的非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌，分別制成懸液，測定吸光度（OD600）并計算菌體濃度，按細胞與細菌比值為1∶5接種菌體于細胞的培養(yǎng)體系中。分別設為非黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細胞組（非黏液型組）與黏液型銅綠假單胞菌+淋巴細胞組（黏液型組），并設置加入磷酸鹽緩沖液（PBS）組為對照組，即PBS+淋巴細胞組。將加入菌液的細胞分別培養(yǎng)12、24、48 h后，1000轉/分離心5 min后收集上清液，等待流式細胞儀進行細胞因子檢測。

4.細胞因子檢測

實驗步驟嚴格按照人Th1/Th2/Th17試劑盒說明書進行。首先渦旋混勻，混合好捕獲微球，向每個實驗管中各加入50 μl，標準管中加入按說明稀釋好的PBS溶液50 μl，樣本管中分別加入稀釋好的非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌樣本液。再向所有實驗管中加入50 μl人Th1/Th2 PE檢測試劑，將所有實驗管室溫避光孵育3 h。將儀器條件設置完畢后，每組試驗管中加入1 ml洗液，200轉/分離心5 min，小心吸去上清液，每管加入300 μl洗液，重懸微球后上機檢測。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0處理數(shù)據(jù)，細胞因子濃度以表示，3組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、銅綠假單胞菌菌落形態(tài)及革蘭染色鏡檢結果

培養(yǎng)皿中可見非黏液型銅綠假單胞菌菌落呈光滑、微隆起、邊緣清晰的均勻菌落，菌落表面呈現(xiàn)金屬光澤。黏液型銅綠假單胞菌菌落形態(tài)呈渾濁膠凍樣，菌落間融合，邊緣不清晰。鏡下觀察，非黏液型銅綠假單胞菌呈兩端鈍圓、單一細胞散點生長，大小約（1 ～ 2）μm×（0.5 ～ 0.7）μm，

無芽孢;黏液型銅綠假單胞菌呈短柄狀、成對或偶有成鏈生長，大小約（1 ～ 3）μm×（0.7 ～ 1.0）μm，無芽孢（圖1）。

二、質譜鑒定結果

經(jīng)質譜分析，非黏液型銅綠假單胞菌和黏液型銅綠假單胞菌質譜結果顯示其波形圖均符合銅綠假單胞菌特征，鑒定結果符合實驗標準（圖2）。

三、細胞因子分泌情況

通過流式法分析淋巴細胞分泌細胞因子情況，可以看出黏液型組與非黏液型組和對照組有明顯差異（圖3）。黏液型組（圖3C） 與非黏液型組（圖3B）均可見TNF-α分泌（自上到下順序，色帶5），差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。黏液型組顯著分泌IL-6（色帶3），且隨培養(yǎng)時間的推移，分泌升高;而非黏液型組（圖3B）與對照組（圖3A）類似，幾乎無IL-6分泌，5次試驗各組測定均值見表1。

討論

銅綠假單胞菌誘導淋巴細胞過度分泌IL-6的是黏液型銅綠假單胞菌，而并非為非黏液型銅綠假單胞菌。早在2010年Ciornei等對細菌在生物膜中的生長是否觸發(fā)特異性免疫的研究顯示，相對銅綠假單胞菌浮游菌，其生物膜形成菌型能夠刺激機體產(chǎn)生更多的IL-6[7]。而IL-6是判斷細菌生物膜形成和慢性重癥感染僅有的幾種檢測意義顯著且屬常規(guī)檢測的細胞因子之一，并被用于膿毒癥干預試驗[8]。體內外研究顯示，過多的IL-6能促進細菌增殖，這意味著除了感染初期天然免疫導致的中性粒細胞或巨噬細胞等分泌IL-6之外，應該還有導致IL-6持續(xù)合成與分泌的機制。已有研究證實，IL-6是由TNF和IL-1的原代細胞因子直接誘導的。IL-6在機體受感染刺激后迅速出現(xiàn)，2 h內其水平可達到峰值，在血流中的持續(xù)時間比TNF和IL-1長得多[9]。早期分泌的IL-6對炎癥和免疫反應的作用是多效的，其可迅速誘導體內產(chǎn)生大量的急性期活性蛋白和促進淋巴細胞特異性分化，在天然免疫應答與獲得性免疫應答中發(fā)揮重要作用，這些機制也導致了IL-6的持續(xù)合成[10]。我們的研究顯示，在銅綠假單胞菌與淋巴細胞共培養(yǎng)的體系中，非黏液型組與對照組僅產(chǎn)生極其微量或近于不產(chǎn)生IL-6，而黏液型組在相同的培養(yǎng)條件下卻產(chǎn)生了大量的IL-6，這證實了銅綠假單胞菌可以刺激淋巴細胞大量分泌IL-6，但產(chǎn)生此作用的是黏液型銅綠假單胞菌。有研究顯示在鑒別膿毒癥和非感染性SIRS時，IL-6的最佳切點為500 pg/ml，一旦超過該切點，則意味著體內已有膿毒癥和慢性生物膜感染存在的可能[11]。我國田素飛等（2007年）的研究同樣提示在體系中的IL-6水平為100 pg/ml以下時，無論是6 h或8 h甚至更長時間，細菌均無太大幅度的增殖，而在IL-6水平達到500 pg/ml時細菌的增殖幅度則驟升。而且，隨著IL-6濃度的增加和時間的推移，在IL-6水平接近或達到500 pg/ml以后，細菌增殖幅度可能更顯著，加大對淋巴細胞的刺激能力，形成惡性刺激循環(huán)。

黏液型銅綠假單胞菌較非黏液型銅綠假單胞菌具有更大免疫刺激作用的原因在于前者可產(chǎn)生大量的藻酸鹽而更易形成生物膜。在固體培養(yǎng)基上觀察到藻酸鹽的過量產(chǎn)生形成的體外表型正是銅綠假單胞菌的黏液型表現(xiàn)[12]。既往我們對宿主免疫反應的大部分知識來自于浮游病原體，而對生物膜病原體的特異性免疫反應研究較少，唯一肯定的區(qū)別是后者菌體較難被清除，使生物膜感染成為慢性感染的主要原因[13]。黏液型銅綠假單胞菌較易產(chǎn)生生物膜，生物膜是產(chǎn)生大的免疫刺激作用的物質基礎，它提供了一個非常集中的穩(wěn)定的病原體相關分子模式（銅綠假單胞菌黏多糖）來源，包括DNA、脂多糖和胞外多糖。這些生物膜的胞外物質可以有效刺激中性粒細胞和巨噬細胞，而不必直接接觸細菌細胞[14-15]。另有研究者證實了銅綠假單胞菌生物膜基質外細胞DNA也是重要的免疫刺激因素和主要的促炎成分[15]。他們通過運用脫氧核糖核酸酶Ⅰ降解基質細胞外DNA，明顯降低了銅綠假單胞菌生物膜誘導中性粒細胞促炎細胞因子IL-8和IL-1b的釋放能力（> 75%），而IL-1可通過激活IL-6核轉錄因子刺激炎癥細胞合成和釋放IL-6;減少了中性粒細胞活化標記CD18、CD11b和CD66b的上調;降低了每個接觸生物膜的中性粒細胞吞噬細菌的數(shù)量。因此生物膜參與了誘導中性粒細胞促炎細胞因子的釋放能力。我們認為，作為形成銅綠假單胞菌生物膜起因的黏液型銅綠假單胞菌是導致銅綠假單胞菌具有更大免疫刺激作用的菌型。

IL-6的過度分泌是難愈性感染的表現(xiàn)特征或潛在的發(fā)生機制，早已有研究者發(fā)現(xiàn)IL-6與慢性重癥感染的嚴重程度及預后密切相關，故將其納入了重癥感染或膿毒癥的臨床評級與預測[17-19]。進一步的研究也顯示在重癥感染得到控制后，患者的IL-6水平顯著下降[20]。高水平的IL-6可顯著提高細菌的增殖能力，這使感染更難被控制，成為難愈性感染的可能發(fā)生機制[5-7]。細菌如何利用細胞因子來促進自身的增殖，目前尚未明確其機制。細菌是原核生物，缺乏明確的細胞核，而細胞因子主要作用于有明確細胞核的真核細胞，繼而可通過信號轉導事件調控基因轉錄完成細胞的增殖與分化。不過，有研究者曾在金黃色葡萄球菌表面鑒定出IL-1β受體，并發(fā)現(xiàn)其中的208 ～ 240肽片段對金黃色葡萄球菌生長的影響最為顯著，與對照組（牛血清白蛋白）相比，該肽片段可使金黃色葡萄球菌的生長速度提高約22倍[21]。因此，可能是細菌細胞膜通過受體介導的信號轉導誘導了激活過程，作用于細菌特定的基因轉錄和翻譯，產(chǎn)生了促進細菌增殖的作用。

總之，本研究結果顯示，是黏液型銅綠假單胞菌促進了淋巴細胞產(chǎn)生過多的IL-6，從而可能刺激了細菌的生長。據(jù)此我們認為，這可能是銅綠假單胞菌引起慢性難愈性感染的重要原因。但在臨床實踐中，細菌這種“適量抑菌-過量促菌”的雙向作用的根本原因可能在于感染后期細菌生物膜的形成，形成了“細菌感染-生物膜形成-細胞因子生成增多-促進細菌再增殖”的惡性循環(huán)，切斷這一惡性過程的重要措施是設法消除生物膜的形成[22]。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-04-18）

（本文編輯：洪悅民）