巴戟天不同極性萃取相的抗氧化及降血糖活性

曾鐵鑫，姚志仁，李豫，朱開梅，蘭圓圓，顧生玖

(桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 桂林，541100)

巴戟天為龍膽目茜草科植物巴戟天(MorindaofficinalisHow)的干燥根莖[1], 是四大南藥之一, 有補(bǔ)腎助陽(yáng)，祛風(fēng)除濕的功效, 主治陽(yáng)痿、少腹冷痛、小便不禁、子宮虛冷、風(fēng)寒濕痹、腰膝酸痛等[2]。而且巴戟天作為南藥特色藥食同源植物，具有較高的食用和藥用價(jià)值，被廣泛運(yùn)用于各種保健食品中[3]。

抗氧化劑是能捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對(duì)人體損害的一類物質(zhì)[4]，可以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力, 是預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的常用物質(zhì)[5]。隨著生活中誘發(fā)自由基產(chǎn)生的輻射增多以及人類對(duì)健康越來(lái)越重視，抗氧化劑已成為食品以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[6]，而目前常用的抗氧化劑多為西藥, 有較多毒副作用，且不能有效地控制并發(fā)癥[7]。中草藥作為植物天然產(chǎn)物抗氧化劑廣泛分布于自然界中，且在長(zhǎng)期食用中沒有表現(xiàn)出低毒性的跡象[8]，其具有多途徑、多靶點(diǎn)、多向性且毒副作用小的藥理特點(diǎn)，近來(lái)越來(lái)越受到人們關(guān)注[9-11]。

目前，雖然關(guān)于巴戟天抗氧化活性研究已有報(bào)道，但多為寡糖成分的研究，而對(duì)于天然抗氧化劑主要評(píng)價(jià)成分多酚類、黃酮類等較少見報(bào)道[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定巴戟天提取物不同極性萃取相總黃酮、總多酚含量，以及不同極性萃取相磷鉬酸體外抗氧化活性和對(duì)DPPH自由基、羥自由基的清除能力和抑制α-葡萄糖苷酶的能力[13]，以期尋找總黃酮、總多酚含量最高的萃取相以及抗氧化活性和降血糖能力最強(qiáng)的萃取相，為巴戟天資源在天然氧化劑和降血糖食品領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

巴戟天藥材，由中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基，梯希愛(上海)有限公司；抗壞血酸(Vc)，天津福晨化工試劑公司；α-葡萄糖苷酶(5×106U/mL)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷(P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ，PNPG),Sigma公司；阿卡波糖,百靈威科技有限公司; 福林-酚(folin-ciocalteu),生工生物工程股份有限公司；沒食子酸,成都市科龍化工試劑廠；槲皮素,天津一方科技有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高速中藥粉碎機(jī)，義海納電器有限公司；樂祺電子天平，?，幮码娮涌萍加邢薰?；全波長(zhǎng)Epoch酶標(biāo)儀，海閃譜生物科技有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，巴玖實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 樣品制備

取巴戟天的根莖自然風(fēng)干粉碎后過(guò)40目篩，稱取粗粉1 000 g按料液比1∶10(g∶mL)加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，置于室溫浸泡1周后減壓抽濾，將抽濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮，60 ℃真空干燥得巴戟天乙醇提取物。稱取60 g乙醇提取物,用100 mL 60 ℃超純水稀釋，采用有機(jī)溶劑萃取法[14-15]對(duì)巴戟天乙醇提取物進(jìn)行萃取，加入等體積石油醚反復(fù)萃取樣品 至石油醚層無(wú)色，采用同樣方法得到乙酸乙酯層、正丁醇層、氯仿層，以及萃取完剩下的水相部分。提取結(jié)束后立即進(jìn)行總多酚、總黃酮含量測(cè)定以及抗氧化能力測(cè)定、自由基清除能力和抑制α-葡萄糖苷酶能力測(cè)定。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 各萃取組分總多酚、總黃酮含量測(cè)定

(1)總多酚含量測(cè)定：參考文獻(xiàn)[16]方法并做適當(dāng)修改。繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別取1 mg/mL氯仿相、石油醚相、醇提物相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相溶液在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，平行實(shí)驗(yàn)3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各極性萃取相總多酚含量。

(2)總黃酮含量測(cè)定：參考文獻(xiàn)[17]方法并做適當(dāng)修改。繪制槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別取1 mg/mL氯仿相、石油醚相、醇提物相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相溶液在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，平行實(shí)驗(yàn)3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各極性萃取相總黃酮含量。

1.4.2 鉬藍(lán)比色法抗氧化能力的測(cè)定

采用鉬藍(lán)比色法[18-19]。稱取2 g磷鉬酸用40 mL 95%乙醇溶解,加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)5% H2SO4溶液配制成磷鉬酸溶液。將巴戟天提取物各極性萃取相分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的樣品溶液,在96孔板內(nèi)加入200 μL磷鉬酸溶液，樣品組加入50 μL不同濃度樣品，空白對(duì)照組以50 μL 1 mg/mL的 Vc溶液替代樣品溶液，樣品對(duì)照組以50 μL 95%乙醇替代樣品溶液，輕搖混勻。95 ℃ 孵育1 h，在705 nm處測(cè)定吸光度。樣品抗氧化能力按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：A1,樣品溶液+磷鉬酸溶液吸光度；A2,樣品溶液+95%乙醇吸光度；A0，Vc 溶液+磷鉬酸溶液吸光度。

1.4.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]的方法并適當(dāng)修改。取7.88 mg DPPH用40 mL無(wú)水乙醇溶解配制成500 μmol/L DPPH-乙醇溶液。將巴戟天提取物各極性萃取相分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的樣品溶液, 并配制相同濃度的Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。在96孔板內(nèi)加入100 μL樣品溶液后再加入100 μL濃度為500 μmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。根據(jù)公式(2)計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率:

(2)

式中：A1,樣品溶液+DPPH-乙醇溶液吸光度；A2,樣品溶液+無(wú)水乙醇吸光度；A0,超純水+DPPH-乙醇溶液吸光度。

1.4.4 羥自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[21-22]的方法并做適當(dāng)修改。將巴戟天提取物各極性萃取相分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的樣品溶液, 并配制相同濃度的Vc溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。取1 mL樣品溶液, 分別加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液, 再加入6 mmol/L H2O2溶液0.1 mL，37℃反應(yīng)30 min, 8 000 r/min離心10 min，510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)公式(3)計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率:

(3)

式中：A1,樣品提取液+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+H2O2溶液吸光度；A2,樣品提取液+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+超純水吸光度;A0,超純水+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+H2O2溶液吸光度。

1.4.5 巴戟天不同極性萃取相提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考文獻(xiàn)[23-25] 方法并做適當(dāng)修改。將巴戟天提取物各極性萃取相分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的樣品溶液,取150 μL不同質(zhì)量濃度巴戟天各極性萃取相提取物加入96孔板內(nèi)，再分別加入10 μL pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液和10 μL 1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，充分混勻后放置于37 ℃ 孵育10 min，再加入50 μL 10 mmol/L的PNPG溶液，孵育30 min后，加入50 μL 1 mol/L 的NaOH溶液終止反應(yīng)。分別設(shè)置空白組、對(duì)照組、樣品組。按照表1加樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

表1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的實(shí)驗(yàn)加樣表

單位：μL

根據(jù)公式(4)計(jì)算樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率:

(4)

式中：A1,樣品組吸光度；A2,空白組吸光度；A0,對(duì)照組吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并得出各極性萃取相相應(yīng)的抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴戟天各極性萃取相總多酚、總黃酮的含量

以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為X軸, 對(duì)應(yīng)吸光度為Y軸, 得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.881 7x-0.006 5，R2=0.993 7，質(zhì)量濃度在0～0.02 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性關(guān)系。以槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為X軸, 溶液吸光度為Y軸, 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.732 1x+0.001 5，R2=0.994 8，質(zhì)量濃度在0～0.01 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性關(guān)系。由沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出巴戟天各極性萃取相總多酚含量，其中氯仿相多酚含量最高為(514.97±2.9)mg/g，各極性萃取相中總多酚含量依次為氯仿相>醇提物相>石油醚相>正丁醇相>水層相>乙酸乙酯相。由槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出巴戟天各極性萃取相總黃酮含量，氯仿相黃酮含量最高為(46.3±1.21)mg/g，各極性萃取相中總黃酮含量依次為氯仿相>石油醚相>醇提物相>正丁醇相>乙酸乙酯相>水層相。

表2 巴戟天醇提物各極性萃取相中的總多酚和總黃酮含量 單位：mg/g

2.2 抗氧化能力測(cè)定

2.2.1 鉬藍(lán)比色法測(cè)定抗氧化能力

以Vc為對(duì)照對(duì)巴戟天提取物各萃取相進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)，由圖1可知,各極性萃取相均有一定的抗氧化活性，在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),氯仿相抗氧化能力最強(qiáng)為73.9%，高于同濃度巴戟天其他極性萃取相。巴戟天各極性萃取相抗氧化能力大小為氯仿相>乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相>水層相>醇提物相。

圖1 巴戟天各極性萃取相抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of polar phases of M.officinalis How with different polarity

2.2.2 對(duì)·OH的清除能力

如圖2所示,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)巴戟天各極性萃取相均有一定的清除羥自由基活性,當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí),氯仿相清除·OH的活性最強(qiáng),對(duì)·OH清除率為59.6%。巴戟天各極性萃取相對(duì)·OH清除率大小依次為氯仿相>石油醚相>正丁醇相>乙酸乙酯相>水層相>醇提物相。氯仿相各濃度對(duì)·OH的清除率均高于同濃度下其他各極性萃取相?？梢宰C明巴戟天清除·OH活性成分主要集中在氯仿相。

圖2 巴戟天各極性萃取相對(duì)·OH清除率Fig.2 Relative hydroxyl radical scavenging rate of M.officinalis How with different polarity

2.2.3 對(duì)DPPH自由基的清除能力

如圖3所示,隨著濃度升高巴戟天各極性萃取相對(duì)DPPH自由基顯示出不同程度的清除活性，且氯仿相最高，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，氯仿相對(duì)DPPH自由基清除率為68.0%。巴戟天氯仿相清除率遠(yuǎn)高于同濃度下其他相對(duì)DPPH自由基清除率。由此證明，巴戟天清除DPPH自由基活性成分主要集中在氯仿相。

圖3 巴戟天不同極性萃取相對(duì)DPPH自由基清除率Fig.3 Relative DPPH radical scavenging rate of M.officinalis How with different polarity

2.3 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

由圖4可知,巴戟天不同極性萃取相均對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,且在一定濃度范圍內(nèi)呈線性變化，氯仿相抑制效果最為明顯且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖。巴戟天各相對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制力強(qiáng)弱為氯仿相>阿卡波糖>石油醚相>醇提物相>乙酸乙酯相>正丁醇相>水層相。而氯仿相在濃度1 mg/mL時(shí)抑制率為97.9%，其各濃度抑制率都高于其他相，可以證明巴戟天中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分主要集中在氯仿相。

圖4 巴戟天不同極性萃取相對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.4 Relative α-glucosidase inhibition rates of M.officinalis How with different polarity

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了巴戟天各極性萃取相的總多酚、總黃酮含量，以及測(cè)定了各極性萃取相體外抗氧化、降血糖能力。結(jié)果表明,巴戟天總多酚含量最高的為氯仿相(514.97±2.9)mg/g，總黃酮含量最高的也為氯仿相(46.3±1.21)mg/g。巴戟天各極性萃取相均有一定的體外抗氧化能力及抑制α-葡萄糖苷酶能力，并在一定濃度范圍內(nèi)與樣品濃度呈線性相關(guān)。在質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)氯仿相磷鉬酸抗氧化能力達(dá)到73.9%，對(duì)DPPH自由基清除率為68.0%，對(duì)·OH清除率為59.6%，均高于其他相；雖弱于公認(rèn)的天然抗氧化劑Vc,但也有很強(qiáng)的抗氧化能力。對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制力最強(qiáng)的也是氯仿相，且氯仿相抑制力強(qiáng)于同濃度陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖，抑制活性極好?？梢缘贸霭完祗w外抗氧化、降血糖主要活性成分集中在氯仿相。結(jié)果表明，巴戟天提取物氯仿相總多酚、總黃酮含量均高于其他相，且體外抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性也高于其他相，是巴戟天提取物的主要活性部位。在抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)中，氯仿相的活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖，在1 mg/mL時(shí)達(dá)到97.9%。在巴戟天各極性萃取相中總多酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于總黃酮含量，可以初步推測(cè)其主要活性成分為多酚類物質(zhì)。本文為巴戟天在天然氧化劑和降血糖食品方面的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。