HPLC一測多評法同時(shí)測定慢肝養(yǎng)陰片中7種成分含量

趙志國，姚建華，王婧寧，翟瑩瑩

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑管理部，遼寧 沈陽 110032；2.沈陽飛龍藥業(yè)有限公司，遼寧 本溪 117004）

慢肝養(yǎng)陰片由地黃、黨參、五味子、枸杞子等10味中藥加工而成，主要用于慢性肝炎、肝炎后綜合癥的治療[1]?，F(xiàn)代研究表明，慢肝養(yǎng)陰制劑治療慢性乙型肝炎[2]、病毒性肝炎[3]臨床效果顯著，可有效降低抗結(jié)核藥物所致肝損害的發(fā)生率，促進(jìn)患者規(guī)律、有效地完成抗結(jié)核化療過程[4-5]；其聯(lián)合替比夫定強(qiáng)化治療慢性乙型肝炎效果確切[6]。慢肝養(yǎng)陰片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]（國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ04592009-2016）和文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]中僅對方中五味子醇甲進(jìn)行定量研究，未對方中所含其他成分進(jìn)行研究。中藥及其制劑，尤其是中成藥復(fù)方制劑組方藥物較多，所含成分多樣，通過各成分的整體協(xié)同作用達(dá)到臨床的治療效果，單一成分的質(zhì)量控制模式難以全面反映中成藥復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。高效液相色譜（HPLC）一測多評法利用中藥各成分間存在的一定內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，通過建立內(nèi)參物與各成分間的相對校正因子，實(shí)現(xiàn)同時(shí)測定多種成分，已在中藥及其制劑的質(zhì)量控制中得以逐步應(yīng)用。本文參考質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，采用HPLC一測多評法對慢肝養(yǎng)陰片方中君藥地黃所含代表性成分梓醇、地黃苷D和益母草苷，黨參所含主要活性成分黨參炔苷和丁香苷，五味子所含代表性成分五味子醇甲和五味子乙素為檢測指標(biāo)，選取五味子醇甲為內(nèi)參物，對慢肝養(yǎng)陰片中7種成分進(jìn)行同時(shí)測定，為提高和完善慢肝養(yǎng)陰片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有力的數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Waters 1525型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；MSA125P 電子分析天平（德國Sartorius公司）；Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Alltima C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試藥

丁香苷對照品（批號(hào)：111574-201605，CAS號(hào)：118-34-3，含量：95.2 %），五味子醇甲對照品（批號(hào)：110857-201815，CAS號(hào)：7432-28-2，含量：99.7 %），五味子乙素對照品（批號(hào)：110765-201813，CAS號(hào)：61281-37-6，含量：99.1 %）均來源于中國食品藥品檢定研究院；益母草苷對照品（批號(hào)：16052422，CAS號(hào)：52949-83-4，含量：94.6 %，上海同田生物技術(shù)股份有限公司）；梓醇對照品（批號(hào)：PRF8052221，CAS號(hào)：2415-24-9，含量：99.9 %），地黃苷D對照品（批號(hào)：14061708，CAS號(hào)：81720-08-3，含量：98.8%），黨參炔苷對照品（批號(hào)：PRF8092221，CAS號(hào)：136085-37-5，含量：99.0 %）均來源于成都普思生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。慢肝養(yǎng)陰片（規(guī)格：每片重0.4 g，批號(hào)：2021809，2021811，2021903）均來源于浙江新明珠藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 單成分對照品儲(chǔ)備液 精密稱取梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素對照品各適量，加甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為1.182，0.458，0.604，0.982，0.126，1.158，0.692 mg/ml的單成分對照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 混合對照品溶液 精密吸取2.1.1項(xiàng)下7種單成分對照品儲(chǔ)備液2.5 ml，用甲醇稀釋至50 ml，制成梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素質(zhì)量濃度分別為59.1，22.9，30.2，49.1，6.3，57.9，34.6 μg/ml的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液 取慢肝養(yǎng)陰片數(shù)片，除去薄膜衣后，研成細(xì)粉，取1.0 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，精密加入甲醇25 ml，稱重，超聲提取30 min，放冷后稱重，用甲醇補(bǔ)重后過濾，制成慢肝養(yǎng)陰片供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液 按國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ04592009-2016中慢肝養(yǎng)陰片的工藝處方分別制備缺地黃、缺黨參、缺五味子的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～11.0 min，12.0 %A；11.0～25.0 min，12.0 %A→18.0 %A；25.0～39.0 min，18.0 %A→41.0 %A；39.0～52.0 min，41.0 %A→78.0 %A；52.0～60.0 min，78.0 %A→12.0 %A）；體積流量：1.0 ml/min；檢測波長分別為210 nm（0～25.0 min檢測梓醇、地黃苷D和益母草苷）[10-12]、266 nm（25.0～39.0 min檢測黨參炔苷和丁香苷）[13-14]和250 nm（39.0～60.0 min檢測五味子醇甲和五味子乙素）[12]；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μl。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取2.1.2～2.1.4項(xiàng)下制備的各溶液和空白溶劑，按2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素峰形對稱，與相鄰色譜峰分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均≥3500，陰性樣品對慢肝養(yǎng)陰片中梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素的測定無干擾。見圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1項(xiàng)下單成分對照品儲(chǔ)備液各0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.5 ml，置入6個(gè)20 ml量瓶，分別用甲醇稀釋至刻度，制成6個(gè)系列濃度混合對照品溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件測定，記錄梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素色譜峰峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（ρ），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

表1 7種成分的線性方程及線性范圍

2.4.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素峰面積的RSD分別為0.63 %，1.09 %，0.96 %，0.77 %，1.14 %，0.52 %和0.85 %。

取同一批號(hào)慢肝養(yǎng)陰片樣品，按2.1.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素的峰面積，計(jì)算得7種成分含量的RSD分別為1.01 %，1.36 %，1.15 %，1.09 %，1.85 %，0.98 %和1.27 %。

取慢肝養(yǎng)陰片供試品溶液，于配制后0，2，4，8，12，18 h，按2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素色譜峰的峰面積，結(jié)果慢肝養(yǎng)陰片供試品溶液18 h內(nèi)穩(wěn)定，7種成分峰面積的RSD分別為1.29 %，1.01 %，1.08 %，1.15 %，0.62 %，0.98 %和1.33 %。

2.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 取7種成分含量已知的慢肝養(yǎng)陰片樣品數(shù)片，除去薄膜衣，研成細(xì)粉，取9份，每份0.5 g，精密稱定，隨機(jī)分成3組，每組3份，分別精密加入混合對照品溶液（梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素質(zhì)量濃度分別為0.376，0.148，0.211，0.338，0.049，0.433，0.247 mg/ml）1.0，2.0和3.0 ml，使對照品加入量約為樣品含有量的50 %，100 %和150 %，再按2.1.3項(xiàng)供試品溶液制備方法制成加樣供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測，7種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 7種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

0.4805 0.2873 0.4440 0.7234 98.22 0.5122 0.3123 0.4440 0.7453 98.87 0.5084 0.3040 0.4440 0.7405 98.31益母草苷 0.5028 0.4279 0.2110 0.6354 98.34 98.48 1.05 0.4931 0.4196 0.2110 0.6261 97.87 0.4863 0.4138 0.2110 0.6219 98.63 0.5109 0.4348 0.4220 0.8513 98.70 0.5136 0.4422 0.4220 0.8505 97.96 0.4978 0.4066 0.4220 0.8302 96.35 0.4805 0.4089 0.6330 1.0411 99.87 0.5122 0.4444 0.6330 1.0639 99.21 0.5084 0.4326 0.6330 1.0617 99.38黨參炔苷 0.5028 0.6808 0.3380 1.0209 100.62 100.00 0.69 0.4931 0.6677 0.3380 1.0085 100.83 0.4863 0.6585 0.3380 0.9983 100.53 0.5109 0.6918 0.6760 1.3647 99.54 0.5136 0.7035 0.6760 1.3714 100.00 0.4978 0.6469 0.6760 1.3413 98.71 0.4805 0.6506 1.0140 1.6652 100.06 0.5122 0.7071 1.0140 1.7008 99.34 0.5084 0.6884 1.0140 1.7062 100.37丁香苷 0.5028 0.0965 0.0490 0.1436 96.12 96.98 1.30 0.4931 0.0947 0.0490 0.1419 96.33 0.4863 0.0934 0.0490 0.1407 96.53 0.5109 0.0981 0.0980 0.1944 98.27 0.5136 0.0998 0.0980 0.1938 97.14 0.4978 0.0917 0.0980 0.1899 96.22 0.4805 0.0923 0.1470 0.2390 99.80 0.5122 0.1003 0.1470 0.2395 96.05 0.5084 0.0976 0.1470 0.2393 96.39五味子醇甲 0.5028 0.8678 0.4330 1.3004 99.91 99.30 0.83 0.4931 0.8511 0.4330 1.2801 99.08 0.4863 0.8394 0.4330 1.2712 99.72 0.5109 0.8818 0.8660 1.7408 99.19 0.5136 0.8968 0.8660 1.7555 100.35 0.4978 0.8247 0.8660 1.7046 97.62 0.4805 0.8293 1.2990 2.1102 98.61 0.5122 0.9013 1.2990 2.1729 99.21 0.5084 0.8775 1.2990 2.1763 99.98五味子乙素 0.5028 0.4932 0.2470 0.7404 100.08 97.80 1.42 0.4931 0.4837 0.2470 0.7231 96.92 0.4863 0.4771 0.2470 0.7195 98.14 0.5109 0.5012 0.4940 0.9933 99.62 0.5136 0.5097 0.4940 0.9825 96.90 0.4978 0.4687 0.4940 0.9682 97.15 0.4805 0.4714 0.7410 1.1889 96.83 0.5122 0.5123 0.7410 1.2328 98.56 0.5084 0.4987 0.7410 1.2101 96.01

2.5 一測多評法的建立

2.5.1 相對校正因子的計(jì)算 精密吸取2.4.1項(xiàng)下制備的6個(gè)線性考察混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素色譜峰的峰面積，以五味子醇甲為內(nèi)參物，按相對校正因子計(jì)算公式?k/s=?k/?s=（ρk×As）/（ρs×Ak）（式中ρk為內(nèi)參物五味子醇甲質(zhì)量濃度，As為其他待測成分的峰面積，ρs為其他待測成分的質(zhì)量濃度，Ak為內(nèi)參物五味子醇甲的峰面積）分別計(jì)算梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷和五味子乙素的相對校正因子。結(jié)果見表3。

2.5.2 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素色譜峰的峰面積，以五味子醇甲為內(nèi)參物，分別考察2種品牌高效液相色譜儀（Agilent 1100型、Waters 1525型）和3種品牌色譜柱（Diamonsil C18色譜柱、Eclipse XDB-C18色譜柱、Alltima C18色譜柱）對梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷和五味子乙素相對校正因子的影響，結(jié)果見表4。

2.5.3 不同流速對相對校正因子的影響 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素色譜峰的峰面積，以五味子醇甲為內(nèi)參物，分別考察不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 ml/min）對梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷和五味子乙素相對校正因子的影響，結(jié)果見表5。

2.5.4 不同實(shí)驗(yàn)人員對相對校正因子的影響 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素色譜峰的峰面積，以五味子醇甲為內(nèi)參物，分別考察3名實(shí)驗(yàn)人員對梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷和五味子乙素相對校正因子的影響，結(jié)果見表6。

表3 慢肝養(yǎng)陰片中各成分的相對校正因子

表4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響

表5 不同流速對相對校正因子的影響

表6 不同實(shí)驗(yàn)人員對相對校正因子的影響

2.5.5 待測組分色譜峰的定位 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素色譜峰的保留時(shí)間，以內(nèi)參物五味子醇甲色譜峰為基準(zhǔn)峰，采用相對保留時(shí)間值法對色譜峰定位，分別考察2種品牌高效液相色譜儀（Agilent 1100型、Waters 1525型）和3種品牌色譜柱（Diamonsil C18色譜柱、Eclipse XDB-C18色譜柱、Alltima C18色譜柱）對梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷和五味子乙素相對保留時(shí)間值的影響，結(jié)果見表7。

2.6 慢肝養(yǎng)陰片含量測定中一測多評法（QAMS）與外標(biāo)法（ESM）的結(jié)果比較

取3個(gè)批號(hào)的慢肝養(yǎng)陰片樣品適量，按2.1.3項(xiàng)下方法，每個(gè)批號(hào)平行制備慢肝養(yǎng)陰片供試品液3份，按2.2項(xiàng)色譜條件下依法進(jìn)樣測定梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素的峰面積，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算各成分的含量，計(jì)算相對平均偏差（RAD）。結(jié)果見表8。

3 討論

3.1 定量檢測指標(biāo)成分及內(nèi)參物的選擇

慢肝養(yǎng)陰片由地黃、黨參、五味子、枸杞子等10味中藥組方而來，方中地黃清熱養(yǎng)陰，枸杞子滋補(bǔ)肝腎，合為君藥；五味子生津補(bǔ)腎，麥冬、北沙參養(yǎng)陰生津，川楝子疏肝柔肝，合為臣藥；黨參、人參健脾補(bǔ)氣、提高免疫力，桂枝溫經(jīng)通陽、防滋膩太過，合為佐藥；當(dāng)歸引藥入肝經(jīng)，為使藥。諸藥共奏，以達(dá)養(yǎng)陰清熱、滋補(bǔ)肝腎的臨床功效。中藥質(zhì)量是中藥臨床療效的保障，中藥質(zhì)量標(biāo)志物已成為中藥質(zhì)量評價(jià)與質(zhì)量控制的核心概念。本文參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物以君藥為首選，同時(shí)兼顧臣佐使藥的確認(rèn)原則，選取慢肝養(yǎng)陰片方中君藥地黃所含代表性成分梓醇、地黃苷D和益母草苷，黨參所含主要活性成分黨參炔苷和丁香苷，五味子所含代表性成分五味子醇甲和五味子乙素為定量檢測指標(biāo)成分，為全面評價(jià)慢肝養(yǎng)陰片內(nèi)在產(chǎn)品質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持；所選7種定量檢測指標(biāo)成分中五味子醇甲性質(zhì)較為穩(wěn)定，對照品價(jià)廉易得，同時(shí)慢肝養(yǎng)陰片中五味子醇甲成分含量較高，故選取五味子醇甲作為內(nèi)參物，采用HPLC一測多評法同時(shí)測定慢肝養(yǎng)陰片中7種成分。

表7 不同儀器、色譜柱條件下各成分的相對保留時(shí)間值

表8 一測多評法與外標(biāo)法測得的慢肝養(yǎng)陰片中各成分的含量（n=3）/mg·g-1

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，以指標(biāo)成分梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素的綜合提取率為首選指標(biāo)，同時(shí)兼顧雜質(zhì)峰干擾情況，依次對比考察了不同提取溶劑：甲醇[11-17]、95 %乙醇溶液、60 %甲醇溶液[10]和不同提取方式：超聲提取法、加熱回流提取法。結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑時(shí)，待測成分綜合提取率最佳，雜質(zhì)成分干擾相對較小；超聲提取和加熱回流提取所測成分綜合提取率無顯著差異，但加熱回流提取雜質(zhì)干擾較大。同時(shí)通過試驗(yàn)摸索，最終確定以甲醇超聲提取30 min制備慢肝養(yǎng)陰片供試品溶液。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)以指標(biāo)成分梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素的峰形及分離效果為首先指標(biāo)，同時(shí)兼顧色譜峰基線的平穩(wěn)情況，首先考察基礎(chǔ)流動(dòng)相甲醇-水和乙腈-水[13-17]，結(jié)果表明，以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖基線漂移嚴(yán)重，干擾各成分檢測；乙腈-水流動(dòng)相體系檢測時(shí)基線平穩(wěn)，但丁香苷和五味子醇甲色譜峰拖尾嚴(yán)重，與相鄰峰分離度不符合要求?？紤]到磷酸溶液可改善峰形，遂采用乙腈-0.2 %磷酸溶液[11-12]為流動(dòng)相，同時(shí)不斷優(yōu)化流動(dòng)相中乙腈和0.2 %磷酸溶液比例，最終確定以乙腈-0.2 %磷酸溶液為流動(dòng)相，同時(shí)測定慢肝養(yǎng)陰片中7種指標(biāo)性成分。

本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC一測多評法同時(shí)測定慢肝養(yǎng)陰片中梓醇、地黃苷D、益母草苷、黨參炔苷、丁香苷、五味子醇甲和五味子乙素的含量，建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確。建立了慢肝養(yǎng)陰片多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，為提升慢肝養(yǎng)陰片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和全面評價(jià)其內(nèi)在產(chǎn)品質(zhì)量提供了數(shù)據(jù)支持。