G1-熵權(quán)法結(jié)合正交試驗優(yōu)選銀怡片水提工藝

劉洪波，王秋菊，高如意，曹苗苗，

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

銀怡片是針對中老年女性等骨質(zhì)疏松人群開發(fā)的具有增加骨密度功能的保健食品，由葛根、骨碎補、檸檬酸鈣、硫酸軟骨素等組成。其中葛根、骨碎補經(jīng)水提、濃縮、干燥得到干膏粉，再與配方中其他原料混合制成片劑。配方中葛根為藥食同源中藥，味甘、辛、涼，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有與雌二醇相當(dāng)?shù)目构琴|(zhì)疏松作用，為預(yù)防和治療女性閉經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥安全而有效的原料[1-4]。骨碎補為可用于保健食品的中藥，味苦性溫，歸肝、腎經(jīng)，有補腎強骨、調(diào)節(jié)骨代謝的功能，廣泛用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥[5-8]。本實驗應(yīng)用G1-熵權(quán)法結(jié)合正交試驗，以加水量、提取時間和提取次數(shù)為考察因素，以葛根素、總黃酮提取量和出膏率為評價指標(biāo)，優(yōu)選銀怡片的最佳水提工藝，以期篩選出合理可行的工藝參數(shù)，為其進一步生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津泰斯特）；UV-2700紫外分光光度計（日本島津）；Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫）；JY電子天平（深圳華測）；HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）。

1.2 材料

葛根素對照品（含量：95.5 %，中國食品藥品檢定研究院，批號110857-201412）；蘆丁對照品（含量：92.6 %，中國食品藥品檢定研究院，批號10080-201409），甲醇（色譜純，上海星可），其他試劑為分析純，水為去離子水。

葛根（批號 Y1708051，產(chǎn)地：陜西）為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根；骨碎補（批號Y1709052，產(chǎn)地：貴州）為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze) J.Sm.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液的制備

按配方稱取葛根138 g，骨碎補138 g，置入5000 ml圓底燒瓶，加12倍水回流提取2次，每次2 h。濾過，合并提取液，即得。

2.2 葛根素的含量測定[9]

2.2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相甲醇-水溶液（25:75），檢測波長250 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μl，流速1.0 ml/min。理論塔板數(shù)按葛根素峰計算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取葛根素對照品適量，精密稱定，加30 %乙醇制成3.091 mg/ml 溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取2.1項下提取液，搖勻，0.22 μm微孔濾膜（水膜）濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按2.1項提取方法制備葛根陰性提取液，供試品溶液制備方法同2.2.3項，得陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性實驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl，按2.2.1項色譜條件測定，結(jié)果顯示，陰性無干擾。

圖1 對照品（A）、供試品（B）、陰性樣品（C）的HPLC圖譜

2.2.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取2.2.2項下對照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 ml，置入10 ml量瓶，以30 %乙醇定容，按2.2.1項色譜條件測定色譜峰面積，以對照品濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，葛根素回歸方程為A=44 715C-215.93，R2=0.9999，在0.3091～2.4728 mg/ml濃度范圍內(nèi)，葛根素峰面積值與濃度具有良好線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 取葛根素對照品溶液（0.6182 mg/ml），注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，峰面積RSD為0.59 %，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按2.2.1項色譜條件，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進樣檢測，結(jié)果葛根素的峰面積RSD為1.09 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取2.1項下提取液，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.2.1項色譜條件測定，結(jié)果葛根素含量均值為0.8365 mg/ml，含量RSD為0.27 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密吸取已測含量的提取液2.5 ml，置入5 ml量瓶，平行6份，分別精密加入2 mg/ml葛根素對照品溶液1 ml，加水定容至刻度，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項色譜條件測定，計算葛根素回收率，平均回收率為99.87 %，RSD為0.88 %。說明該檢測方法準(zhǔn)確，符合要求。

2.3 總黃酮的含量測定[10]

2.3.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成濃度為52.78 μg/ml的對照品儲備溶液。精密吸取儲備溶液3.0 ml于10 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為15.834 μg/ml的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 吸取2.1項下提取液2 ml于蒸發(fā)皿中，加入1 g聚酰胺粉吸附，水浴揮干，然后轉(zhuǎn)入層析柱。先用20 ml石油醚（30～60 ℃）洗，棄去石油醚液，然后用甲醇洗脫，定容至25 ml，即得。

2.3.3 檢測波長的選擇 取蘆丁對照品（15.834 μg/ml）、供試品、空白（甲醇）3種溶液，在200～500 nm范圍內(nèi)進行掃描，觀察各溶液最大吸收波長。由圖2可知，蘆丁對照品溶液、供試品溶液的最大吸收波長分別為359和375 nm，且在360 nm處有較大吸收，而空白溶液在此波長下無吸收?！侗＝∈称窓z驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中“保健食品中總黃酮的測定”中規(guī)定的檢測波長為360 nm，故以360 nm為檢測波長測定總黃酮含量。

圖2 總黃酮紫外掃描圖

2.3.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取2.3.1項下對照儲備溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml置入10 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為0，5.278，10.556，15.834，21.112，26.390，31.668 μg/ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計于波長360 nm處分別測定吸收度值。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁回歸方程為A=0.026C+0.004，R2=0.9990，線性范圍5.278～31.668 μg/ml。

2.3.5 精密度試驗 取蘆丁對照品溶液（15.834 μg/ml）于360 nm處測定吸光度，連續(xù)測定6次，吸光度RSD為0.07 %，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，于0，30，60，90，120，150 min時測定吸光度，吸光度RSD為0.04 %，表明供試品溶液在150 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取2.1項下提取液，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，測定吸光度，結(jié)果總黃酮含量均值為12.016 μg/ml，含量RSD為0.05 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密吸取已測含量的提取液2.5 ml，置入5 ml量瓶，平行6份，分別精密加入31.668 μg/ml蘆丁對照品溶液1 ml，加水定容至刻度，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算總黃酮回收率，平均回收率為98.82 %，RSD為1.76 %。表明該檢測方法準(zhǔn)確，符合要求。

2.4 出膏率測定

精密量取供試品V1（ml），置入已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿（M1）中，在水浴鍋上蒸至近干，轉(zhuǎn)移至烘箱內(nèi)，105 ℃干燥至恒定質(zhì)量，取出，置干燥器中冷卻至室溫，迅速精密稱定質(zhì)量（M2），計算出膏率。

出膏率=（M2-M1）V2/mV1

式中m為供試品中生藥總質(zhì)量，V2為供試品的總體積。

2.5 正交試驗

在預(yù)試基礎(chǔ)上，按照配方稱取276 g藥材飲片，共9份，以加水倍量（A）、提取時間（B）和提取次數(shù)（C）為考察因素，以葛根素提取量（供試品中葛根素的質(zhì)量/對應(yīng)葛根藥材的質(zhì)量）、總黃酮提取量（供試品中總黃酮的質(zhì)量/對應(yīng)處方藥材的質(zhì)量）和出膏率的綜合評分為評價指標(biāo)，按L9（34）正交試驗因素水平表進行試驗，采用G1-熵權(quán)法計算各指標(biāo)權(quán)重，進行提取工藝優(yōu)化。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

根據(jù)G1法，對3項評價指標(biāo)的重要程度進行排序，其順序關(guān)系為葛根素提取量＞總黃酮提取量＞出膏率，并確定各指標(biāo)的權(quán)重評價標(biāo)度為r2=1.4，r3=1.2，由下列計算公式（1）～（2）求得各指標(biāo)的主觀權(quán)重值w1。根據(jù)各提取工藝試驗數(shù)據(jù)，采用公式（3）～（5）計算各指標(biāo)客觀權(quán)重值w2。采用公式（6）計算各指標(biāo)的組合權(quán)重w，采用公式（7）最終求得各評價對象的綜合評分[11]。各指標(biāo)權(quán)重見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，各因素對綜合指標(biāo)的影響主次順序為C＞B＞A，即提取次數(shù)＞提取時間＞加水倍量，由表4可知，C因素差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提取次數(shù)3水平最佳，A和B因素差異無統(tǒng)計學(xué)意義，選擇加水倍量10倍，提取時間1.5 h。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，最佳提取工藝為A2B2C3，即每次加10倍量水，提取3次，提取時間為每次1.5 h。

表2 提取工藝評價指標(biāo)權(quán)重值

表3 正交試驗安排及結(jié)果

表4 綜合評價指標(biāo)的方差分析

2.6 驗證試驗

為確證該工藝的穩(wěn)定性，按配方稱取葛根、骨碎補飲片各138 g，共3份，根據(jù)優(yōu)選的工藝條件進行3批驗證試驗，結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果

由表5可見，3批驗證數(shù)據(jù)無顯著差異，表明優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

在提取工藝中，G1-熵權(quán)法既可反映各評價指標(biāo)在不同提取條件下的變化規(guī)律，又可同時兼顧決策者的主觀性，提高了數(shù)據(jù)的合理性和結(jié)果的科學(xué)性，故本研究采用G1-熵權(quán)法對葛根素提取量、總黃酮提取量和干膏率3個評價指標(biāo)進行賦權(quán)，計算其綜合評分。

采用傳統(tǒng)的水提工藝提取銀怡片中葛根、骨碎補，通過現(xiàn)代技術(shù)對其提取工藝進行篩選，最終確定提取工藝參數(shù)。驗證試驗結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定可行，為銀怡片的進一步開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。