采用差速貼壁法培養(yǎng)動(dòng)物及人細(xì)胞研究進(jìn)展

印文靜，顏海華，馮亞松，田 潔，王勝軍 (.江蘇省泰州市第四人民醫(yī)院，江蘇 泰州 5300;.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 03)

細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的重要技術(shù)之一，在細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、臨床檢驗(yàn)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，成為闡釋生命現(xiàn)象、發(fā)病機(jī)理和篩選藥物的重要手段，已成為醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分之一［1］。差速貼壁法由Kreider和Pleasure等較早報(bào)道［2］。該方法更加便于研究者簡便探索細(xì)胞特別是胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)制，并有利于對結(jié)果進(jìn)行精確、快速的檢測。因此通過單層貼壁誘導(dǎo)途徑進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)、分化的研究報(bào)道越來越多［2］。本文對近年來采用差速貼壁法培養(yǎng)動(dòng)物及人細(xì)胞的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述如下。

1 干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞是具有自我更新和多向分化能力的一類增殖旺盛的細(xì)胞，具有向機(jī)體各種組織細(xì)胞分化的潛能［3］。徐超等運(yùn)用差速貼壁法分離鼠纖維母細(xì)胞(MEF)和小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)［4］，實(shí)驗(yàn)不但找到了分離MEF和ES的最佳時(shí)間(約1.5 h)，而且結(jié)果還顯示，差速貼壁后的GD3細(xì)胞仍然擁有保持其干細(xì)胞的全能性，其單克隆的形成率也和差速貼壁前的GD3細(xì)胞無顯著差異，在很大程度上為差速貼壁法在干細(xì)胞分化中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)證明。李甫強(qiáng)等運(yùn)用差速貼壁法分離純化綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［5］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著首次換液時(shí)間的延長，貼壁細(xì)胞密度增多，BMSCs的比例減少。首次換液時(shí)間在接種后2 h的細(xì)胞純度高，但細(xì)胞密度低;24 h后的細(xì)胞密度高而純度低;8 h后的細(xì)胞密度大具有較高的純度，傳代后的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠BMSCs能穩(wěn)定表達(dá)GFP。傅淑平等采用差速貼壁法觀察梓醇對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及骨向分化的影響［6］。結(jié)果表明，梓醇具有促BMSCs增殖及骨向分化的作用。而所采用的差速貼壁法為實(shí)驗(yàn)提供了較好的技術(shù)手段。劉虎仙等重復(fù)利用Ⅳ型膠原以差速貼壁法分選表皮干細(xì)胞［7］，研究表明，利用快速貼壁法可以得到較高純度的表皮干細(xì)胞，合理回收利用Ⅳ型膠原以快速貼壁法分選表皮干細(xì)胞是一種實(shí)用而經(jīng)濟(jì)的方法。丁維進(jìn)等運(yùn)用改良的差速貼壁法分離肌源干細(xì)胞［8］，研究結(jié)果提示應(yīng)用改良的差速貼壁法和有限稀釋技術(shù)可以分離得到小鼠來源肌源干細(xì)胞及其克隆集落。

袁軍等探討差速貼壁法從早期人胚股骨分離、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的可行性，并觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化［9］。研究結(jié)果表明，原代培養(yǎng)第3天可見塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)有長梭形細(xì)胞生長，至第10天前后形成集落樣克隆，傳至第4代后呈單層漩渦狀排列的長梭形的成纖維樣細(xì)胞，已無明顯細(xì)胞克隆形成，經(jīng)多次傳代，細(xì)胞保持良好的增殖能力和穩(wěn)定的性狀;免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示未誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元烯醇化酶、神經(jīng)巢蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白陰性，誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)元烯醇化酶、神經(jīng)巢蛋白呈陽性，膠質(zhì)纖維酸性蛋白陰性，間接證實(shí)培養(yǎng)所得細(xì)胞是BMSCs。他們認(rèn)為差速貼壁培養(yǎng)法從早期人胚股骨中分離純化BMSCs，去除可能的成纖維細(xì)胞污染，是簡便有效的，可供有關(guān)研究參考選擇。

2 嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞

田鋒等采用經(jīng)改良的取材和差速貼壁法培養(yǎng)純化嗅SD大鼠黏膜嗅鞘細(xì)胞(OECs)［10］，以探求更加簡單、高效的嗅黏膜OECs取材和培養(yǎng)純化方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的嗅黏膜OECs形態(tài)主要有扁圓形或油煎蛋形、梭形或雙極、多突起形，培養(yǎng)14 d嗅黏膜OECs純度為85%，嗅黏膜OECs最長可以存活35 d。研究認(rèn)為，采用改良的取材和差速貼壁法培養(yǎng)、純化的嗅黏膜OECs，方法簡單、高效，培養(yǎng)的嗅黏膜OECs的純度可以達(dá)到細(xì)胞移植的要求。李玉安等探討單次差速貼壁法純化培養(yǎng)成年大鼠嗅球嗅鞘細(xì)胞的可行性，實(shí)驗(yàn)通過18 h單次差速貼壁法純化培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞經(jīng)NGFRp75免疫熒光鑒定后，純度可達(dá)70% ～80%，形態(tài)上以雙極和三極細(xì)胞為主，伴有少許單極及多極細(xì)胞［11］。研究結(jié)果表明，應(yīng)用18 h單次差速貼壁法純化培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞是一種簡便、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、快捷的方法。

王斌等采用不同純化方法原代培養(yǎng)人胚嗅球嗅鞘細(xì)胞(OECs)［12］，以差速貼壁法為基礎(chǔ)結(jié)合阿糖胞苷法、無血清饑餓法和間斷神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)法純化培養(yǎng)人胚嗅球OECs，觀察不同純化方法下OECs生長變化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行純度鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，差速貼壁結(jié)合間斷NT3法可獲得高純度狀態(tài)良好的OECs，是一種簡單實(shí)用的OECs純化培養(yǎng)方法。

3 內(nèi)皮祖細(xì)胞

李辰運(yùn)等采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞［13］，于包被人纖連蛋白的25 ml培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，收集48 h后的未貼壁細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，差速貼壁法是獲得穩(wěn)定、高純度的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)方法。

李建輝等利用免疫組化、免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)對培養(yǎng)的人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定，建立一種內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法［14］，研究也同樣表明，差速貼壁法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的經(jīng)濟(jì)、可靠、穩(wěn)定。

4 其他細(xì)胞

陳振兵等采用Ⅺ型膠原酶和胰蛋白酶消化法及差速貼壁法分離細(xì)胞獲取小鼠肌源性干細(xì)胞，進(jìn)行體外原代和傳代培養(yǎng)［15］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用差速貼壁法可從失神經(jīng)骨骼肌內(nèi)分離出肌源性干細(xì)胞，體外培養(yǎng)的肌源性干細(xì)胞具有良好的增殖能力，適用于組織工程和基因治療。孫浩林等采用胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶先后消化Wistar大鼠椎間盤髓核組織，差速貼壁法分離純化大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞［16］。研究結(jié)果表明，原代培養(yǎng)、兩次差速貼壁法分離純化的大鼠髓核細(xì)胞代謝旺盛、表型一致。張群等將人毛囊外根鞘細(xì)胞(HHORSC)接種在Ⅸ型膠原涂被的培養(yǎng)皿上進(jìn)行黏附分選，試驗(yàn)組細(xì)胞和對照組細(xì)胞分別進(jìn)行K15、β1-整合素、外皮蛋白免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并測定克隆形成率［17］。研究結(jié)果表明試驗(yàn)組 K15和β1-整合素的表達(dá)分別為(70.1±6.7)% 和(82.4±9.3)%，對照組相應(yīng)為(32.1±8.9)% 和(30.3±1.3)%，外皮蛋白兩組間的表達(dá)為(26.7±8.6)%和(79.2±15.3)%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。研究認(rèn)為差速貼壁法可初步分選、純化人毛囊干細(xì)胞。

采用差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)具有經(jīng)濟(jì)、可靠、速度快、不用抗有絲分裂藥物抗血清和補(bǔ)體等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物及人組織細(xì)胞的培養(yǎng)上具有廣泛用途。但由于該方法本身的缺陷，成纖維細(xì)胞含量高于其他方法，在使用該方法培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需多加注意。但我們相信該方法將在以后的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

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［12］ 王 斌，賀西京，歷 強(qiáng)，等.不同純化方法體外培養(yǎng)人胚嗅球嗅鞘細(xì)胞［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，39(6):1023.

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［15］ 陳振兵，洪光祥，陳燕花，等.差速貼壁法體外培養(yǎng)失神經(jīng)骨骼肌肌源性干細(xì)胞的生物學(xué)特性［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10(33):7.

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