p62 基因缺失對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂的促進(jìn)作用

曾瑞霞,張軼博

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001）

肥胖發(fā)生的根本原因是脂肪細(xì)胞體積變大和數(shù)量增多，而后者很大程度上是由于脂肪分化異常所致［1-3］。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）作為脂肪細(xì)胞形成的源頭，其增殖能力和分化潛能直接決定了成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量，影響脂肪組織的結(jié)構(gòu)與構(gòu)成。p62 是自噬-溶酶體系統(tǒng)中重要的中介分子［4-5］，p62 基因敲除的小鼠發(fā)生肥胖和胰島素抵抗，白色脂肪組織中脂肪積累增加，脂肪內(nèi)脂質(zhì)的合成增加［6］。自噬相關(guān)基因7（autophagy-related gene 7，Atg7）敲除的小鼠以及Atg7 缺失的小鼠3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的研究顯示：脂肪組織中總脂肪堆積量和脂滴數(shù)量減少，且脂滴體積縮小，小鼠3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少，表明自噬被抑制后可降低甘油三酯積累，抑制脂肪細(xì)胞分化。線粒體自噬是一種選擇性自噬，即自噬泡膜上有識(shí)別受損線粒體的特異受體，并對(duì)其針對(duì)性地進(jìn)行降解，這對(duì)于維持線粒體正常的數(shù)量和功能非常重要。目前，關(guān)于脂肪分化的研究多以小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞為模型，本研究選用人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose-derived stromal cells，hADSCs）作為研究對(duì)象進(jìn)行脂肪分化研究，該細(xì)胞與小鼠3T3-L1 細(xì)胞比較更接近人的生物學(xué)狀態(tài)，對(duì)疾病的預(yù)防和治療更具有指導(dǎo)意義。肥胖和高脂飲食有密切關(guān)聯(lián)［7-8］，而油酸（oleic acid，OA）是動(dòng)物油和植物油中常見(jiàn)的游離脂肪酸，也是血液游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）含量最多的成分，將其替代3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，可在一定程度上模擬人體的生理作用模式。p62 是否通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化而影響肥胖的發(fā)生尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，故本研究構(gòu)建p62 shRNA 慢病毒載體，探討p62 基因缺失對(duì)hADSCs 成脂能力的影響以及與自噬之間的關(guān)系。脂肪分化過(guò)程中伴隨著脂滴的形成及甘油三酯的合成，而線粒體是脂肪酸氧化的核心場(chǎng)所，因此在明確自噬在hADSCs 成脂過(guò)程中的基本作用后，進(jìn)一步探討線粒體自噬與p62 基因在hADSCs 成脂中的作用及關(guān)系，為更深入闡明人脂肪分化的分子機(jī)制和尋找新藥的作用靶點(diǎn)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象、主要試劑和儀器脂肪組織取自3 例大腿皮下脂肪抽吸術(shù)者（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院整形外科），供者均為25～35 歲的健康女性，并對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意。單丹磺酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）（大連寶生物工程有限公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（美國(guó)Invitrogen 公司），Mitotraker Red 探針（美國(guó)Invitrogen 公司），一抗兔抗人β-actin、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 α（CCAAT/enhancer binding protein alpha，CEBPα）、p62 單克隆抗體和羊抗兔IgGHRP 二抗（美國(guó)Sigma 公司）。DP71 型正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），PRISM 7300 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）。

1.2 p62 基因的shRNA 引物合成和慢病毒載體構(gòu)建根據(jù)GenBank 公布的人p62 基因核苷酸序列（NM_001142299），人p62 基因特異性shRNA 靶序列（5'-GCAGATGAGGAAGATCGCCTT-3'）的設(shè)計(jì)、合成以及慢病毒載體的構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。

1.3 hADSCs 的分離和培養(yǎng)將皮下脂肪抽吸液裝入50 mL 離心管，0.1%的Ⅰ型膠原酶進(jìn)行消化，于37℃水浴箱作用1 h；加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，1 500 r·min－1離心10 min，棄上清，留沉淀；將沉淀使用7 mL 低糖DMEM 進(jìn)行吹打混勻，200 目網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液；1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，留沉淀；L-DMEM 吹打混勻沉淀，將其移入75cm2的培養(yǎng)瓶中，放入5% CO2、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 OA誘導(dǎo)hADSCs的脂肪分化采用80 μmol·L－1OA、10 mg·L－1胰島素和1 μmol·L－1地塞米松在hADSCs 成脂的全程進(jìn)行持續(xù)誘導(dǎo)10 d，鏡下觀察成脂情況。

1.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)繪制hADSCs 生長(zhǎng)曲線將對(duì)照組和p62 基因缺失組hADSCs 接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×103個(gè)細(xì)胞，并于接種后0～7d檢測(cè)細(xì)胞活性，每孔加入10μLCCK-8溶液，于37℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用分光光度計(jì)在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值，以A值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)天數(shù)（d）為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 Western blotting法檢測(cè)hADSCs中p62、C/EBPα 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hADSCs 接種于6孔水平板中，待細(xì)胞達(dá)50%融合后加入重組慢病毒感染。24h后PBS緩沖液沖洗3次，待細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)2d，誘導(dǎo)10d，進(jìn)行尼羅紅染色。于接種后10d采用Western blotting法檢測(cè)hADSCs中p62、C/EBPα和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)水平。

1.7 MDC 熒光染色檢測(cè)自噬囊泡將P3 代hADSCs 接種到放有蓋玻片的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，3d后進(jìn)行染色觀察。將細(xì)胞用PBS 緩沖液清洗3次后，換為含MDC的培養(yǎng)基37℃孵育10min，PBS緩沖液洗滌2次，取出蓋玻片，用紫外光激發(fā)，于倒置熒光顯微鏡下觀察和攝片。

1.8 Mitotracker Red 熒光共定位檢測(cè)hADSCs 中線粒體自噬活性將P3 代hADSCs 接種到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，3d后加入200 nmol·L－1的MitotrackerRed進(jìn)行染色15 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min。加入2 mL 0.1%Trition X-100 作用20 min；10%山羊血清封閉30 min；加入兔抗人LC3多克隆抗體，4℃過(guò)夜；加入Alexa Fluor 鼠抗兔IgG 二抗，避光，37℃孵育1 h。將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計(jì)數(shù)各組含脂滴細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組hADSCs細(xì)胞增殖活性，MDC染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，各組hADSCs中p62、C/EBPα和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs 的形態(tài)表現(xiàn)分離培養(yǎng)的hADSCs接種24h后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，呈短梭形。接種4d后，細(xì)胞開(kāi)始增殖，并充分伸展，呈多角形或梭形。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，呈漩渦狀排列（圖1）。

2.2 光鏡下觀察OA 誘導(dǎo)hADSCs 成脂后脂滴的形成選取80 μmol·L－1OA 聯(lián)合地塞米松和胰島素對(duì)hADSCs 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)10 d，光鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴形成（圖2）。

2.3 hADSCs 生長(zhǎng)曲線將慢病毒shp62 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h 后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果顯示：細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。采用CCK-8 比色法繪制生長(zhǎng)曲線（圖3），結(jié)果顯示：在培養(yǎng)7 d 內(nèi)，生長(zhǎng)曲線呈“S”形，但p62 基因缺失組生長(zhǎng)曲線較低，細(xì)胞增殖緩慢；在培養(yǎng)5 和6 d 后p62 基因缺失組細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

圖3 2 組hADSCs 的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of hADSCs in two groups

2.4 尼羅紅染色結(jié)果和hADSCs 中C/EBPα 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，p62 基因缺失組hADSCs 誘導(dǎo)脂肪分化至第3 天時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞內(nèi)已出現(xiàn)微小的脂滴，而對(duì)照組誘導(dǎo)第5 天才有脂滴出現(xiàn)；誘導(dǎo)分化至8～10 d，脂滴更豐富，細(xì)胞進(jìn)一步變大變圓，尼羅紅染色顯示有豐富的脂滴，尼羅紅脂滴染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多（圖4）。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：p62基因缺失組C/EBPα 蛋白表達(dá)水平（1.40±0.10）較對(duì)照組（0.80±0.10）明顯升高（P＜0.01）（圖5）。

圖5 Western blotting 法檢測(cè)2組hADSCs中C/EBPα 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of C/EBPα protein in hADSCs in two groups detected by Western blotting method

2.5 MDC 染色結(jié)果和hADSCs 中LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平MDC 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組MDC熒光呈彌散分布，p62 基因缺失組為點(diǎn)狀聚集，胞漿內(nèi)熒光顆粒顯著增多，熒光強(qiáng)度增加（圖6），MDC 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（26.13±1.24）較對(duì)照組（16.34±1.42）明顯增加（P＜0.05）。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示： p62 基因缺失組hADSCs 中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平（0.80±0.10）較對(duì)照組（0.33±0.15）明顯升高（P＜0.01）（圖7）。

圖7 Western blotting 法檢測(cè)2 組 hADSCs 中 LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)電泳圖Fig.7 Electrophoregram of expressions of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰproteins in hADSCs in two groups detected by Western blotting method

2.6 Mitotracker Red 熒光共定位檢測(cè)hADSCs 中線粒體自噬活性與對(duì)照組比較，在分化3 d，p62基因缺失hADSCs 中LC3 的點(diǎn)狀化和顆?；龆?，與線粒體的共定位現(xiàn)象增加（圖8）。在分化10 d，光鏡下計(jì)數(shù)含脂滴細(xì)胞數(shù)（圖9），對(duì)照組為（26.67±1.53）個(gè)，p62 基因缺失組為（87.33±2.52）個(gè)，環(huán)孢菌素 A（cyclsporin A，CsA）組為（14.67±2.52）個(gè)，p62 基因缺失+CsA 組為（32.33±2.51）個(gè)。當(dāng)p62 基因缺失引起線粒體自噬的增加被CsA 抑制后，其促進(jìn)成脂的作用也被抑制，降低到接近對(duì)照組的水平。

3 討論

p62 基因敲除小鼠出現(xiàn)肥胖和胰島素抵抗，基礎(chǔ)脂水解變慢，并在其脂肪組織中發(fā)現(xiàn)脂滴數(shù)量增多，甘油三酯合成增加，脂肪細(xì)胞體積增大。本研究將慢病毒shp62 轉(zhuǎn)染至hADSCs 中，內(nèi)源p62 基因沉默后，再進(jìn)行成脂分化，結(jié)果顯示：尼羅紅染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，調(diào)節(jié)成脂的關(guān)鍵分子C/EBPα 的蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明p62 基因缺失明顯增強(qiáng)了hADSCs 的成脂能力。干細(xì)胞的自我復(fù)制能力，也是干細(xì)胞維持“穩(wěn)態(tài)”的一種體現(xiàn)，而p62 基因缺失降低hADSCs 的自我復(fù)制能力，在一定程度上表明干細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的能力下降，可能趨向分化。

鑒于p62 作為自噬發(fā)生的重要中介物質(zhì)，以及自噬在肥胖中的研究，本研究探討p62 基因與自噬在hADSCs 成脂中的相互作用，MDC 染色及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示：p62 基因的缺失在促進(jìn)成脂過(guò)程中激活了自噬。研究［4］顯示：如果p62 基因缺失，與p62 基因參與介導(dǎo)有關(guān)的自噬將降低；而本研究結(jié)果則顯示：hADSCs 中p62 基因缺失導(dǎo)致自噬活性增強(qiáng)，與報(bào)道［4］結(jié)果相反，推測(cè)其可能原因：由于p62 基因也可介導(dǎo)泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）對(duì)小分子蛋白的降解，因此p62 基因缺失后，很多由p62 基因介導(dǎo)的小分子物質(zhì)不能被UPS 清除，在細(xì)胞內(nèi)大量聚集，后者可通過(guò)其他中介分子形成復(fù)合體，進(jìn)而通過(guò)自噬進(jìn)行降解，因此細(xì)胞的自噬活性增強(qiáng)。

研究［9-10］顯示：線粒體在維持干細(xì)胞自我更新和定向分化中具有重要作用，當(dāng)干細(xì)胞走向分化時(shí)，線粒體逐漸“成熟”，數(shù)量增加，功能增強(qiáng)。成脂過(guò)程中線粒體增加可能與以下2 個(gè)因素有關(guān)：①細(xì)胞分化過(guò)程需要線粒體提供足夠的ATP 以保證細(xì)胞發(fā)生重建；②分化后成熟的脂肪細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴形成，線粒體的數(shù)量和功能對(duì)于脂滴及甘油三酯的合成有重要作用。Mitotracker Red 探針對(duì)于線粒體的染色是親脂的，不依賴于線粒體膜電位［11-12］。通過(guò)Mitotracker Red 探針標(biāo)記線粒體（紅色）和LC3 免疫熒光標(biāo)記自噬體（綠色）不僅可以分別觀察自噬體和線粒體［13-14］，也可以在共聚焦顯微鏡下觀察二者的共定位，以確定線粒體自噬的發(fā)生［15-17］。本研究中Mitotracker Red 探針標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示：p62 基因缺失細(xì)胞中LC3 的點(diǎn)狀化和顆?；龆?，并觀察到與線粒體的共定位現(xiàn)象增加，表明二者的復(fù)合體增多，提示p62 基因缺失在hADSCs 成脂中促進(jìn)線粒體自噬。本研究使用CsA抑制線粒體自噬，當(dāng)p62 基因缺失引起線粒體自噬的增加被CsA 抑制后（CsA+p62 基因缺失），其促進(jìn)成脂的作用也被抑制，表明p62 基因缺失導(dǎo)致的成脂增加與線粒體自噬作用增強(qiáng)有關(guān)。關(guān)于p62 基因缺失如何會(huì)增強(qiáng)線粒體自噬，可能與p62 基因在機(jī)體中對(duì)線粒體作用的雙面性有關(guān)：p62 基因既可作為中介分子介導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生，也可穩(wěn)定線粒體的形態(tài)使其免受損傷而抑制線粒體自噬的發(fā)生［18-20］。

綜上所述，在hADSCs 脂肪分化過(guò)程中，p62基因缺失不僅導(dǎo)致自噬流增加，而且使得自噬流的分布不均：線粒體導(dǎo)向的自噬流增多，保證了hADSCs 分化中所需大量線粒體的更新，使分化進(jìn)一步延續(xù)，脂質(zhì)合成逐漸增加，最終使得成脂增加。