疏肝和胃丸對糖尿病胃輕癱模型大鼠胃電節(jié)律及胃竇Cajal 間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的影響

林輝，孫必強(qiáng)，黃群

（1.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012；2.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南 株洲 412000）

0 引言

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis,DGP)為糖尿病常見慢性并發(fā)癥[1]，胃竇Cajal 間質(zhì)細(xì)胞 (interstitial cells of Cajal，ICC）作為胃腸道動力的起搏細(xì)胞，能通過調(diào)節(jié)胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)的慢波，從而掌控胃腸道的自主節(jié)律運(yùn)動。有研究表明[2]ICC 的數(shù)量減少、功能降低、超微結(jié)構(gòu)破壞等是導(dǎo)致糖尿病患者胃腸平滑肌正常收縮功能發(fā)生障礙的重要機(jī)制?；贗CC 已經(jīng)成為治療DGP 的重要靶點，本研究從ICC 表達(dá)和胃電節(jié)律角度，探索疏肝和胃丸治療DGP 的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

Wistar 大鼠150 只，60-80 日齡，體重（200±20）g，雄性，湖南省斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供（許可證號：SYXK（湘）2011-0003），飼養(yǎng)溫度25℃，濕度50%，分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 藥物與試劑

多潘立酮片（10 mg/片，西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：H10910003）。注射用鏈脲佐菌素（Steptozotocin，STZ，美國Sigma 公司）；檸檬酸（天津市博迪化工有限公司）；兔抗c-kit 多克隆抗體(一抗)(武漢博士德生物公司)。

疏肝和胃丸中藥飲片由本校中藥教研室采購經(jīng)鑒定為真品，按每劑中加蒸餾水500 mL，煎煮40 分鐘，過濾，濃縮為浸膏，每克浸膏含生藥18.75 g，冷藏備用。

1.3 造模方法及分組

高糖高脂飼料喂養(yǎng)2 周，禁食不禁水12 h，編號后隨機(jī)抽取10 只為正常組，余為造模組。參照文獻(xiàn)[3]造模：造模組動物在第1 天和第8 天分別兩次腹腔注射新鮮配制1%STZ 液，注射劑量為45 mg/kg，正常組大鼠相應(yīng)腹腔注射0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液，注射劑量為1 mL/只。第2 次STZ 注射后6w 尾尖采血測空腹血糖（Fasting Blood Glucose，F(xiàn)BG）。選取FBG＞16.7 mmol/L 同時伴有腹部脹大、體質(zhì)量減輕等胃輕癱癥狀動物隨機(jī)分為模型組、西藥組、疏肝和胃丸低、中、高劑量組，每組20 只。

1.4 給藥方法

西藥組每日按臨床劑量1 倍（0.5 mg/kg）給予多潘立酮灌胃，疏肝和胃丸低、中、高劑量組按臨床劑量1 倍（生藥1.5 g/kg）、2 倍（生藥3.0 g/kg）、4 倍（生藥6.0 g/kg）每日灌胃，給藥體積均為10 mL/kg，模型組與正常組予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥4 周。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.5.1 胃電節(jié)律的測定

大鼠禁食、禁水12 h，固定，采用10%烏拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉，腹部脫毛，75%酒精脫脂，采用美國MP150 型多導(dǎo)生理信號儀采集體表胃電描記。測定胃電慢波主頻率和主功率，描記30 min。

1.5.2 胃竇ICC 數(shù)量的檢測

取幽門附近胃竇組織約1.0 cm×1.0 cm，生理鹽水沖洗、4%多聚甲醛固定24 小時，常規(guī)石蠟包埋、間斷連續(xù)切片、脫蠟、抗原修復(fù)。滴加c-Kit-抗體(按1:100 稀釋)，37 ℃恒溫箱孵育2 h，先后滴加生物素標(biāo)記的二抗和鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，恒溫箱孵育15 min，DAB 顯色2 min 左右。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察染色情況。陽性結(jié)果判斷：細(xì)胞胞漿染色呈棕褐色者判定為陽性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃電節(jié)律與胃竇ICC 表達(dá)的比較

其他各組胃電主頻率、主功率均低于空白組，差異顯著（P＜0.01）；疏肝和胃丸各組胃電主頻率、主功率顯著高于模型組（P＜0.01），低于西藥組（P＜0.05），疏肝和胃丸各組胃竇ICC 表達(dá)顯著高于模型組（P＜0.01），低于西藥組（P＜0.05），詳見表1。

2.2 胃竇ICC 數(shù)量的檢測結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下可見：在胃竇組織肌層之間夾雜者形狀為圓形或邊緣不規(guī)則的細(xì)胞即為c-kit 陽性ICC 細(xì)胞。見圖1 所示，空白組c-kit 的ICC 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量較多。圖2 示，與空白組比較，模型組大鼠c-kit 呈（+）的ICC 表達(dá)減少(P＜0.05）；與模型組比較，疏肝和胃丸高中低劑量組大鼠c-kit呈（+）的ICC 表達(dá)顯著增加(P＜0.05）。

表1 各組大鼠胃電節(jié)律與胃竇 ICC 表達(dá)的比較（±s）

表1 各組大鼠胃電節(jié)律與胃竇 ICC 表達(dá)的比較（±s）

注：a 與空白組比較P＜0.01；b 與模型組比較P＜0.01；c 與西藥組比較P＜0.05

圖1 空白組

圖2 模型組

圖3 高劑量組

圖4 中劑量組

圖5 低劑量組

圖6 西藥組

3 討論

DGP 的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，其中以ICC 為代表的組織學(xué)變化受到重視。ICC 數(shù)量的減少和形態(tài)結(jié)構(gòu)變化受多種因素調(diào)控，SCF/c-kit 信號通路在參與ICC 的增殖、分化以及表型維持等生理過程其中起著重要的作用[4]。當(dāng)c-kit 受體被SCF 活化后，c-kit 與SCF 結(jié)合，通過活化細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶及磷脂酰肌醇-3 激酶 (PI3K) 激活多個信號途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)[5]。電針[6]與中藥[7]均可通過促進(jìn)mSCF 蛋白表達(dá)，上調(diào)SCF/c-kit 信號通路，增加DGP 大鼠胃竇組織內(nèi)ICC 數(shù)量。

根據(jù)DGP 的臨床表現(xiàn)可歸于“胃痛”、“胃痞”、“嘔吐”范疇，病機(jī)上當(dāng)屬氣病，乃脾胃虛弱，肝氣橫逆克土，胃氣上逆所致。疏肝和胃丸是一臨床使用多年經(jīng)驗方，具有疏肝和胃，降逆止嘔，行氣止痛之功，由柴胡、佛手、姜半夏、木香、柿蒂等八味中藥組成，臨床用于DGP 治療效果較好。前期實驗研究顯示該方可通過增加胃粘膜血流量而具有較好的胃粘膜保護(hù)[8]及促胃腸動力作用[9]。前期實驗研究顯示該方促進(jìn)DGP 模型大鼠胃腸動力可能與調(diào)節(jié)血清胃腸激素含量有關(guān)[10]。本研究顯示造模后，模型組動物胃電節(jié)律與胃竇ICC 數(shù)量等指標(biāo)結(jié)果較空白組顯著降低（P＜0.01）。經(jīng)疏肝和胃丸治療后，以上指標(biāo)得到顯著提高（P＜0.01），提示疏肝和胃丸促進(jìn)胃腸蠕動機(jī)制可能與調(diào)節(jié)胃竇組織SCF/c-kit信號通路，促進(jìn)ICC 的增殖、分化有關(guān)，其中的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。