CSE下調(diào)抑制MCF-7細(xì)胞生長增殖的研究

鄒桃

【摘要】目的：下調(diào)或者降低CSE的含量來研究對(duì)于乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長增殖影響。方法：MCF-7轉(zhuǎn)染siRNA，western-blot的方法來檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)量，將獲得的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白含量的灰度值比較，從而確定CSE含量是否得到下調(diào)。MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長活力的差異。從而確定CSE下調(diào)是否抑制細(xì)胞生長。然后通過細(xì)胞周期檢測(cè)來獲得細(xì)胞的生長增殖情況。結(jié)果：siRNA使CSE表達(dá)減少，MTT顯示實(shí)驗(yàn)組明顯比對(duì)照組細(xì)胞活力有所降低，差異顯著性分別為p<0.01，p<0.05，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示CSE下調(diào)明顯抑制MCF-7增殖，使細(xì)胞生長周期阻滯在s期，與對(duì)照組比較有顯著差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：通過轉(zhuǎn)染siRNA的方法使乳腺癌細(xì)胞中CSE含量減少，并且CSE的下調(diào)明顯抑制了細(xì)胞的生長和增殖。

【關(guān)鍵詞】CSE? MCF-7? 乳腺癌細(xì)胞 生長增殖

一、緒論

（1）乳腺癌目前研究。目前乳腺癌前病變機(jī)理的研究，從分子水平上對(duì)癌癥的研究漸漸成為熱點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物越來越成熟，可用來研究更多的新的原癌基因、抑癌基因，研究細(xì)胞凋亡基因和信號(hào)傳導(dǎo)基因等，來了解乳腺癌細(xì)胞治療的方法和突破點(diǎn)，而有利于早期的診斷、早期的預(yù)防治療和后期的復(fù)檢，方便臨床對(duì)乳腺癌進(jìn)行具體分析具體分析。并且采取合理有效的措施。

（2）CSE與硫化氫。最近研究表明硫化氫由胱硫醚β合成酶（CBS），胱硫醚γ裂解酶CSE和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶催化生成，CBS和CSE在細(xì)胞漿內(nèi)生成硫化氫是以L-半胱氨酸作為底物。由此我們可以聯(lián)想到從CSE的層面，來降低硫化氫的表達(dá)量，就會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長和增殖起到一定的作用。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)

含10 %血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。

（二）western-blot檢測(cè)對(duì)照組和經(jīng)過轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞中CSE表達(dá)量及相應(yīng)細(xì)胞活力檢測(cè)

（1）細(xì)胞種板和轉(zhuǎn)染種六孔板，細(xì)胞密度30%-50%，第二天，每孔轉(zhuǎn)染方式如下：a將20pmolsiRNA溶于50ul1640無血清培養(yǎng)基中。b將1ul lip2000溶于50ul無血清1640培養(yǎng)基中，輕彈混勻室溫放置5min。c，將a、b兩管混合，混勻后放置20min。轉(zhuǎn)染期間，將6孔板中的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，每孔400ul。將c管混勻加入6孔板其中一孔中，另一個(gè)孔中加入scRNA，4-6小時(shí)換成有血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h。

（2）提取蛋白和wetern-blot：分別收集處于對(duì)數(shù)生長期的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染siRNA的MCF-7細(xì)胞;用離心機(jī)3500rpm 5min離心，棄上清;向加入1mlpbs，吹勻，移到EP管中，3000rpm 5min;將Ep管中的上清液棄去;離心管加入RIPA和PMSF（100：1）細(xì)胞裂解液， 冰上裂解30 min;裂解完后，用12000rpm，15min，4℃離心;取一部分上清進(jìn)行蛋白定量，另一部分處理后進(jìn)行跑膠80v30min之后轉(zhuǎn)為120v100min;總蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后， 轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 室溫下用5%脫脂牛奶封閉lh;加入一抗4 ℃過夜， 洗膜3次后， 加入二抗后室溫孵育1 h， 再洗膜3次， 經(jīng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（Alpha， USA）檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。β-actin為內(nèi)參蛋白。

（3） MTT檢測(cè)法檢測(cè)對(duì)照組和轉(zhuǎn)染SiRNA組細(xì)胞活。收集對(duì)數(shù)生長期的MCF-7及轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，在37 ℃、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。待細(xì)胞貼壁后，10 μl的5 mg/ml的MTT加入每個(gè)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，然后加入100 μl的DMSO，慢慢搖晃，使結(jié)晶逐漸溶解。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm波長處的吸光度值（OD值），接下來計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率=（實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值）×100%

（三）流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡和細(xì)胞周期

（1）收集細(xì)胞先向種好的六孔板中每孔加入500ul0.25%的胰酶，再分別加入1ml培養(yǎng)基，終止消化。吹打收集入離心管。

（2）細(xì)胞的固定收集之后轉(zhuǎn)速1500r/min離心5min棄上清，用預(yù)冷的PBS洗一遍，再加入300～500 ul預(yù)冷的PBS將細(xì)胞重懸。將細(xì)胞懸液緩慢逐滴加到10 ml預(yù)冷的75%乙醇（用PBS配置）中，用手輕彈。保存到-20度，一周內(nèi)檢測(cè)。

（3）細(xì)胞周期的檢測(cè)固定好之后，進(jìn)行周期的檢測(cè)。取出固定好的細(xì)胞，放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速1500r/min，10 min，再用預(yù)冷的PBS洗兩次，每管加入300～500的DNA染色液（現(xiàn)用現(xiàn)配），需避光放置于37度條件下染色20分鐘。最后用FACS Calibui BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

（4）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有得到的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0應(yīng)用軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以x?± S表示，組間差異顯著性采用t來檢驗(yàn)，p﹤0.05表示組間的差異具有顯著性，p﹤0.01表示組間的差異非常顯著。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）兩株乳腺癌細(xì)胞MCF-7轉(zhuǎn)染CSE siRNA，作用48h。轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，顯影結(jié)果顯示出轉(zhuǎn)染后CSE的表達(dá)量明顯減少，表明轉(zhuǎn)染后下調(diào)了CSE表達(dá)量。

（2）MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率比對(duì)照組存活率顯著降低（p<0.01）CSE下調(diào)抑制了細(xì)胞的生長活力。

（3）CSE下調(diào)阻滯了細(xì)胞周期并抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的結(jié)果表明經(jīng)過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組相比于對(duì)照組，細(xì)胞周期明顯阻滯于s期，s期為細(xì)胞DNA復(fù)制合成期。下調(diào)CSE的表達(dá)量，能夠很明顯的使細(xì)胞周期阻滯在s期，即阻滯了DNA的合成，因此可以得出CSE的下調(diào)抑制了MCF-7細(xì)胞的增殖。

四、結(jié)論

MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染SiRNA后，CSE表達(dá)量降低。CSE的下調(diào)抑制了乳腺癌細(xì)胞的生長。CSE的下調(diào)使細(xì)胞周期阻滯在s期，抑制了細(xì)胞的增殖。

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