鄒桃
【摘要】目的:下調(diào)或者降低CSE的含量來研究對(duì)于乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長增殖影響。方法:MCF-7轉(zhuǎn)染siRNA,western-blot的方法來檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)量,將獲得的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白含量的灰度值比較,從而確定CSE含量是否得到下調(diào)。MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長活力的差異。從而確定CSE下調(diào)是否抑制細(xì)胞生長。然后通過細(xì)胞周期檢測(cè)來獲得細(xì)胞的生長增殖情況。結(jié)果:siRNA使CSE表達(dá)減少,MTT顯示實(shí)驗(yàn)組明顯比對(duì)照組細(xì)胞活力有所降低,差異顯著性分別為p<0.01,p<0.05,細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示CSE下調(diào)明顯抑制MCF-7增殖,使細(xì)胞生長周期阻滯在s期,與對(duì)照組比較有顯著差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:通過轉(zhuǎn)染siRNA的方法使乳腺癌細(xì)胞中CSE含量減少,并且CSE的下調(diào)明顯抑制了細(xì)胞的生長和增殖。
【關(guān)鍵詞】CSE? MCF-7? 乳腺癌細(xì)胞 生長增殖
一、緒論
(1)乳腺癌目前研究。目前乳腺癌前病變機(jī)理的研究,從分子水平上對(duì)癌癥的研究漸漸成為熱點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物越來越成熟,可用來研究更多的新的原癌基因、抑癌基因,研究細(xì)胞凋亡基因和信號(hào)傳導(dǎo)基因等,來了解乳腺癌細(xì)胞治療的方法和突破點(diǎn),而有利于早期的診斷、早期的預(yù)防治療和后期的復(fù)檢,方便臨床對(duì)乳腺癌進(jìn)行具體分析具體分析。并且采取合理有效的措施。
(2)CSE與硫化氫。最近研究表明硫化氫由胱硫醚β合成酶(CBS),胱硫醚γ裂解酶CSE和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶催化生成,CBS和CSE在細(xì)胞漿內(nèi)生成硫化氫是以L-半胱氨酸作為底物。由此我們可以聯(lián)想到從CSE的層面,來降低硫化氫的表達(dá)量,就會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長和增殖起到一定的作用。
二、實(shí)驗(yàn)方法
(一)MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)
含10 %血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃,5% CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。
(二)western-blot檢測(cè)對(duì)照組和經(jīng)過轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞中CSE表達(dá)量及相應(yīng)細(xì)胞活力檢測(cè)
(1)細(xì)胞種板和轉(zhuǎn)染種六孔板,細(xì)胞密度30%-50%,第二天,每孔轉(zhuǎn)染方式如下:a將20pmolsiRNA溶于50ul1640無血清培養(yǎng)基中。b將1ul lip2000溶于50ul無血清1640培養(yǎng)基中,輕彈混勻室溫放置5min。c,將a、b兩管混合,混勻后放置20min。轉(zhuǎn)染期間,將6孔板中的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基,每孔400ul。將c管混勻加入6孔板其中一孔中,另一個(gè)孔中加入scRNA,4-6小時(shí)換成有血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h。
(2)提取蛋白和wetern-blot:分別收集處于對(duì)數(shù)生長期的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染siRNA的MCF-7細(xì)胞;用離心機(jī)3500rpm 5min離心,棄上清;向加入1mlpbs,吹勻,移到EP管中,3000rpm 5min;將Ep管中的上清液棄去;離心管加入RIPA和PMSF(100:1)細(xì)胞裂解液, 冰上裂解30 min;裂解完后,用12000rpm,15min,4℃離心;取一部分上清進(jìn)行蛋白定量,另一部分處理后進(jìn)行跑膠80v30min之后轉(zhuǎn)為120v100min;總蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后, 轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 室溫下用5%脫脂牛奶封閉lh;加入一抗4 ℃過夜, 洗膜3次后, 加入二抗后室溫孵育1 h, 再洗膜3次, 經(jīng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Alpha, USA)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。β-actin為內(nèi)參蛋白。
(3) MTT檢測(cè)法檢測(cè)對(duì)照組和轉(zhuǎn)染SiRNA組細(xì)胞活。收集對(duì)數(shù)生長期的MCF-7及轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μl,在37 ℃、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。待細(xì)胞貼壁后,10 μl的5 mg/ml的MTT加入每個(gè)孔中,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清液,然后加入100 μl的DMSO,慢慢搖晃,使結(jié)晶逐漸溶解。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm波長處的吸光度值(OD值),接下來計(jì)算細(xì)胞存活率,存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%
(三)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡和細(xì)胞周期
(1)收集細(xì)胞先向種好的六孔板中每孔加入500ul0.25%的胰酶,再分別加入1ml培養(yǎng)基,終止消化。吹打收集入離心管。
(2)細(xì)胞的固定收集之后轉(zhuǎn)速1500r/min離心5min棄上清,用預(yù)冷的PBS洗一遍,再加入300~500 ul預(yù)冷的PBS將細(xì)胞重懸。將細(xì)胞懸液緩慢逐滴加到10 ml預(yù)冷的75%乙醇(用PBS配置)中,用手輕彈。保存到-20度,一周內(nèi)檢測(cè)。
(3)細(xì)胞周期的檢測(cè)固定好之后,進(jìn)行周期的檢測(cè)。取出固定好的細(xì)胞,放入離心機(jī)中,轉(zhuǎn)速1500r/min,10 min,再用預(yù)冷的PBS洗兩次,每管加入300~500的DNA染色液(現(xiàn)用現(xiàn)配),需避光放置于37度條件下染色20分鐘。最后用FACS Calibui BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有得到的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0應(yīng)用軟件,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以x?± S表示,組間差異顯著性采用t來檢驗(yàn),p﹤0.05表示組間的差異具有顯著性,p﹤0.01表示組間的差異非常顯著。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(1)兩株乳腺癌細(xì)胞MCF-7轉(zhuǎn)染CSE siRNA,作用48h。轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比,顯影結(jié)果顯示出轉(zhuǎn)染后CSE的表達(dá)量明顯減少,表明轉(zhuǎn)染后下調(diào)了CSE表達(dá)量。
(2)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率比對(duì)照組存活率顯著降低(p<0.01)CSE下調(diào)抑制了細(xì)胞的生長活力。
(3)CSE下調(diào)阻滯了細(xì)胞周期并抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的結(jié)果表明經(jīng)過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組相比于對(duì)照組,細(xì)胞周期明顯阻滯于s期,s期為細(xì)胞DNA復(fù)制合成期。下調(diào)CSE的表達(dá)量,能夠很明顯的使細(xì)胞周期阻滯在s期,即阻滯了DNA的合成,因此可以得出CSE的下調(diào)抑制了MCF-7細(xì)胞的增殖。
四、結(jié)論
MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染SiRNA后,CSE表達(dá)量降低。CSE的下調(diào)抑制了乳腺癌細(xì)胞的生長。CSE的下調(diào)使細(xì)胞周期阻滯在s期,抑制了細(xì)胞的增殖。
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