大麥青稞小孢子高頻再生體系的建立及其在遺傳育種上的應(yīng)用研究

牛姣姣

摘 ? 要：小孢子培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于十字花科類的作物育種中，并且已經(jīng)取得不錯(cuò)的成果，但是在一些禾本科作物方面的應(yīng)用并不大。一方面，小孢子培育技術(shù)的體系建立與實(shí)施難度大，另一方面，應(yīng)用于研究與實(shí)踐的材料基因受限。對(duì)大麥青稞小孢子高頻再生體系的建立與體系優(yōu)化進(jìn)行了闡述，并通過實(shí)際的研究育種及其結(jié)果的獲得，表明采用這種培養(yǎng)技術(shù)方式能夠形成高效的單倍體株系，并經(jīng)過研究團(tuán)隊(duì)的鑒定與品種和品類的試驗(yàn)，篩選出所需要的具有很強(qiáng)抗病、耐病、性狀突出的大麥青稞植株，并且使得小孢子高頻再生技術(shù)得到了改良，具有很大的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值與前景。

關(guān)鍵詞：大麥青稞小孢子高頻再生體系;建立;遺傳育種;應(yīng)用

大麥屬于啤酒業(yè)的主要原料之一，也為畜牧養(yǎng)殖業(yè)提供了很多高質(zhì)量的能量飼料，同時(shí)大麥本身具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是食品加工重要而豐富的原料。大麥對(duì)于國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類的健康生活有著重要的意義。青稞屬于大麥的一種，有著非常高的食用價(jià)值，是青藏高原人們生存與繁衍的最重要食物之一，對(duì)于邊遠(yuǎn)地區(qū)的發(fā)展也極其重要[1]。因此，大麥有著很高的市場(chǎng)需求，在其選育方面顯得尤為重要。

1 ? 大麥小孢子高頻再生體系的建立

在大麥的新品種選育方面，要想提高選育的效率，只有通過提高育種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。近幾年較流行的小孢子培養(yǎng)技術(shù)是一種效率較高的單倍體育種手段，已經(jīng)被應(yīng)用到大麥、油菜、煙草等農(nóng)作物上，只是這種技術(shù)手段在推廣方面還是會(huì)受到一些限制[2]。為了使大麥青稞育種突破這種受限，本文采用了一種在大麥中創(chuàng)建小孢子高頻再生體系的方式，在選取的優(yōu)質(zhì)育種材料中取出小孢子進(jìn)行再生培養(yǎng)，與各地區(qū)的相關(guān)育種團(tuán)隊(duì)進(jìn)行合作，培育優(yōu)質(zhì)的大麥與青稞的新品種或品系，甚至研究出大麥的遺傳改良方法。

對(duì)于生產(chǎn)方面的大麥主栽品種與創(chuàng)建育種材料的小孢子高頻再生體系，是實(shí)踐小孢子技術(shù)的基礎(chǔ)和前提[3]。通過對(duì)小孢子的離體培養(yǎng)再生，獲得大量的加倍單倍體植株，并且建立更永久、穩(wěn)定的植株體系才能滿足需要，然后對(duì)植株分別采取全方位的處理方式，并對(duì)其每個(gè)步驟采取優(yōu)化處理，從而針對(duì)我國(guó)的大麥品種系列建立特有的小孢子高頻再生體系。

通過建立的這一個(gè)高頻再生體系，從不同的大麥育種生態(tài)區(qū)中選擇具有代表性的品系或者品種，并進(jìn)行游離的小孢子培養(yǎng)研究。對(duì)于北方，本次研究所選擇的是來自于黑龍江的墾啤麥7號(hào)和甘肅的甘啤6號(hào);對(duì)于黃、淮地區(qū)，選擇的是秋播大麥;對(duì)于江蘇地區(qū)，選擇的是蘇啤3號(hào);對(duì)于上海地區(qū)，選擇的是花30作為對(duì)照。經(jīng)過研究與試驗(yàn)后結(jié)果呈現(xiàn)出：在選擇的這些品種與品類中，其小孢子再生植株最高頻率是花30，達(dá)到1×105個(gè)/培養(yǎng)皿，也就是平均每培養(yǎng)皿小孢子為378.7株，其會(huì)比栽培其他品種的大麥（栽培品種為253株/1×105個(gè)小孢子），即花22小孢子的再生頻率提高了很多;與國(guó)外所采用的具有很高花培再生頻率的品種，如Igril類的品種而言也更勝一籌，其所采用的最高花培再生頻率為每100個(gè)花藥1 009.8株，其再生綠苗植株數(shù)目的比例為87.6%，根據(jù)每個(gè)花藥達(dá)到3 000個(gè)獲得的游離小孢子，它的再生頻率為每1×105個(gè)小孢子的再生頻率是295株。對(duì)于6號(hào)甘啤，每1×105個(gè)小孢子，其綠苗的再生頻率是216.3株，這種小孢子再生頻率的綠苗比很高。因此，通過數(shù)據(jù)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，選育的4份育種材料小孢子的再生綠苗，單皿都在100株以上。除此之外，還有其他的一些白苗，因此，白苗比例不合理的問題是創(chuàng)建小孢子高頻再生體系過程中所存在的問題之一，有待研究與解決。

針對(duì)于青藏地區(qū)的青稞作物，其小孢子在培養(yǎng)中存在遲鈍基因型問題，還需要對(duì)其高頻再生體系進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化[4]。

2 ? 大麥小孢子高頻再生技術(shù)在育種中的具體應(yīng)用

本研究是基于已經(jīng)創(chuàng)建的小孢子高頻再生技術(shù)之上，并且結(jié)合目前發(fā)展后的小孢子的各種培養(yǎng)和選擇的方法上，例如高鹽、低氮等培養(yǎng)新方法，為我國(guó)東北、內(nèi)蒙古、青海等地區(qū)的大麥青稞進(jìn)行了持續(xù)的小孢子培養(yǎng)，到2018年底已經(jīng)實(shí)現(xiàn)600多份育種材料的培養(yǎng)，并且超過了12萬株的再生植株。近5年左右的小孢子再生植株培育，實(shí)現(xiàn)了每年上萬份的再生與培育，其育苗的成活率高于90%，植株再生結(jié)實(shí)率超過90%。參與實(shí)踐的各大育種團(tuán)隊(duì)通過培育技術(shù)，獲得小孢子的加倍單倍體株系后，立即投入試驗(yàn)中進(jìn)行鑒定性試驗(yàn)與育品試驗(yàn)，從而獲得了一系列的品種與品系優(yōu)良的大麥青稞，大大提升了我國(guó)大麥青稞的區(qū)域育種效率。

基于大麥小孢子的高頻再生技術(shù)，近幾年我國(guó)還對(duì)另外3項(xiàng)的遺傳方法進(jìn)行了新改良，并且已經(jīng)在其具體應(yīng)用上取得一些效果。①獲得專利號(hào)（201510890842.3）的不用經(jīng)過種子進(jìn)行培育的單株小孢子的培養(yǎng)技術(shù)方法。通過小孢子培育花30的高頻再生大麥，一方面實(shí)現(xiàn)了高頻再生的單株小孢子，另一方面實(shí)現(xiàn)了不用經(jīng)過種子階段進(jìn)行培育的高頻再生的植株小孢子，這一培育技術(shù)目前已經(jīng)投入運(yùn)用于大麥花30及西藏地區(qū)野生大麥的F1中進(jìn)行的小孢子培養(yǎng)，解決了野生培育外源基因的栽種難題。②獲得專利號(hào)（201611011357.5）的在小孢子高頻再生體系的培育基礎(chǔ)之上的轉(zhuǎn)基因方法。通過農(nóng)桿菌對(duì)小孢子進(jìn)行直接性的侵染與游離培育，能夠?qū)⑵淠繕?biāo)基因進(jìn)行花30的轉(zhuǎn)換，其轉(zhuǎn)換效率達(dá)到了17%，比通過使用基因槍的方式對(duì)花藥進(jìn)行轟擊方式的效率更高;通過CRISPR/Cas9基因，即在水平方向上對(duì)小孢子的靶向基因（白粉病廣譜抗性基因）進(jìn)行改編，以便提高大麥花30的基因編輯后的效率。③獲得專利號(hào)（201410710796.X）的單倍體的培養(yǎng)方法。通過小孢子培育技術(shù)獲得單倍體植株，通過誘導(dǎo)叢生芽的方式培育單倍體再生植株，持續(xù)進(jìn)行培育至第5代以后經(jīng)過檢測(cè)仍保持單倍體的倍性，以此建立了穩(wěn)定的具有單倍體無性繁殖特性的群體，從而解決了單倍體育種的難題，從當(dāng)下單倍體植株中獲得植物細(xì)胞中葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體，并且對(duì)其轉(zhuǎn)基因與基因進(jìn)行編輯和研究。

3 ? 結(jié)語(yǔ)

大麥青稞小孢子技術(shù)的發(fā)展與研究，使得單倍體植株具有了再生系統(tǒng)，比傳統(tǒng)的花藥培育方法更加有效。據(jù)一些研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在大麥中對(duì)其小孢子進(jìn)行培養(yǎng)與再生的綠苗，相比傳統(tǒng)的采取花藥的方式培育得更加高效，其效率提高了9.3倍，說明采用小孢子培育的方法能夠使得培育后的綠苗比采用傳統(tǒng)的花藥培育在高頻再生方面更具有發(fā)展的潛力。國(guó)內(nèi)外對(duì)于小孢子的培育方面已經(jīng)有不少培育的方法，但是要想使得小孢子的培養(yǎng)技術(shù)能夠達(dá)到育種的目的，不僅需要在生產(chǎn)上進(jìn)行大量的實(shí)踐與研究，攻克其植株的基因障礙，還需要通過高頻再生綠苗的方式得到所需要小孢子再生的植株。另外，這種培養(yǎng)技術(shù)還要用加倍單倍體的方式進(jìn)行輔助。本文所研究與闡述的這套小孢子高頻再生技術(shù)用在大麥青稞大量進(jìn)行育種方面具有很好的效果，有利于促進(jìn)我國(guó)大麥小孢子育種的進(jìn)程，也提高了常規(guī)育種的效率，在市場(chǎng)上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

本文對(duì)突破大麥小孢子育種方面的技術(shù)進(jìn)行研究，創(chuàng)建了高頻再生體系，經(jīng)過單個(gè)培養(yǎng)皿對(duì)小孢子進(jìn)行培養(yǎng)得到了上百株的再生植株，然后在此之上對(duì)單倍體細(xì)胞進(jìn)行多種技術(shù)方式的誘變、篩選、基因編輯等，使得植株細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合。通過小孢子培養(yǎng)的方式，在其中放進(jìn)一些非生物脅迫處理，然后對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)或雜交，使得單倍體植株的耐鹽、耐氮、抗病性等方面得到加強(qiáng)。

經(jīng)過試驗(yàn)表明，采取這樣的雜交、誘變等方式，能夠使得小孢子育種技術(shù)具有很廣的市場(chǎng)應(yīng)用與發(fā)展價(jià)值。近年來，在小孢子培養(yǎng)方式之上發(fā)展出一些不用經(jīng)過單株小孢子培養(yǎng)的方式，對(duì)單倍體群體或其材質(zhì)進(jìn)行編輯與轉(zhuǎn)基因的方式，對(duì)植株細(xì)胞的原生質(zhì)體培養(yǎng)等方式取得了很大的發(fā)展，并且處在不斷的優(yōu)化中。通過研究與實(shí)踐這些培養(yǎng)方法使得大麥的基因遺傳作用被應(yīng)用在市場(chǎng)中，也為同類型谷類作物的遺傳與基因改良提供了可參考的價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 徐齊君，王玉林，原紅軍，等.青稞再生體系的建立及優(yōu)良受體基因型篩選[J].大麥與谷類科學(xué)，2019，36（4）：1-10，38.

[ 2 ] 星曉蓉.油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)及其在遺傳育種中的應(yīng)用研究概況[J].青海農(nóng)林科技，2011（3）：24-26.

[ 3 ] 危文波.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青稞遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的研究[D].西寧：青海大學(xué)，2015.

[ 4 ] 陳志偉，陸瑞菊，黃劍華.大麥空間誘變與小孢子培養(yǎng)復(fù)合育種技術(shù)及應(yīng)用[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（4）：160.