HS-SPME arrow-GC/MS 結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析煙草香氣突變體中特征香氣成分

徐曉玲，曹建敏，龐雪莉，林櫻楠，曹鵬云，劉貫山，孔芳芳，王大海，王德勛，范志勇，邱 軍*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11 號 266101 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12 號 100081 3. 山東濰坊煙草有限公司諸城分公司，山東省濰坊市諸城市密州路37 號 262200 4. 云南省煙草公司大理州公司，云南省大理市下關(guān)鎮(zhèn)鶴慶路71 號 671000

為創(chuàng)新煙草種質(zhì)資源，培育優(yōu)良品種，在煙草基因組計劃重大專項的支持下，研究人員采用化學(xué)誘變劑處理煙草種子，獲得一系列具有特征香韻的煙草高香氣突變體材料，經(jīng)過多年田間鑒定及烤后煙葉感官質(zhì)量評價，培育了多個具有穩(wěn)定遺傳性狀的特征香韻突變品系［1-3］。薩姆遜香突變體材料是其中一種，它是由甲基磺酸乙酯（EMS）誘變烤煙品系中煙100 種子獲得的特征香韻材料，其田間長勢與中煙100 一致，但烤后煙葉感官質(zhì)量具有明顯的香料煙特征香韻，且質(zhì)量評價檔次較高。煙草高香氣突變品系香氣特征的表現(xiàn)與其釋放的香氣成分種類和含量之間存在直接聯(lián)系［4］。煙草揮發(fā)性香氣成分組成復(fù)雜、含量差異大，高效、靈敏的樣品提取方法對煙草特征香氣成分的分離分析結(jié)果有重要影響。SPME arrow 是一種基于固相微萃?。⊿olid-phase microextraction，SPME）技術(shù)的新裝置，近年來得到了日益廣泛的應(yīng)用［5-6］，與常規(guī)SPME 相比，其填料量大、吸附性能好、使用壽命長，可顯著提高方法靈敏度和樣品萃取效率。SPME arrow 在揮發(fā)性物質(zhì)檢測中具有樣品制備簡單，操作方便，測定快速高效，結(jié)果穩(wěn)定性高等優(yōu)勢，已逐漸應(yīng)用于大氣、水和食品等樣品的分析［7-9］。目前，關(guān)于SPME arrow 在煙草揮發(fā)物領(lǐng)域的研究未見報道。因此，本研究中以SPME arrow 技術(shù)為基礎(chǔ)，以薩姆遜香突變體和中煙100 烤后煙葉為試驗材料，采用單因素試驗考察了萃取頭種類、平衡時間、萃取時間和萃取溫度對揮發(fā)性香氣成分萃取效果的影響，結(jié)合GC/MS 非靶標(biāo)分析技術(shù)，建立煙草中揮發(fā)性香氣成分的檢測方法，同時結(jié)合PCA 和PLS-DA 等化學(xué)計量學(xué)手段，揭示薩姆遜香突變體材料的香氣物質(zhì)基礎(chǔ)，明確薩姆遜香突變體與對照中煙100 中香氣成分的差異，旨在為不同香氣風(fēng)格煙草揮發(fā)性香氣成分的分析與數(shù)據(jù)挖掘提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

試驗材料為2018 年山東省諸城市洛莊試驗站種植的特征香韻突變體（薩姆遜香）和對照中煙100（ZY100）的烤后煙葉，等級為C3F，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所生物技術(shù)研究中心提供。

α-紫羅蘭酮（99%，湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司）。

7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；ZZ-SPME-t 固相微萃取加熱臺（青島貞正分析儀器有限公司）；FA2004 電子天平（感量0.000 1 g，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；箭型固相微萃取進(jìn)樣器及4 種SPME arrow 萃取頭，包括PDMS（100 μm×20 mm）、CAR/PDMS（120 μm×20 mm）、DVB/PDMS（120 μm×20 mm）、DVB/CAR/PDMS（120 μm×20 mm）（瑞士CTC 分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理及GC/MS 分析

烤后煙葉樣品去除主脈后，剪成細(xì)片狀，置于烘箱中40 ℃下烘干，磨成煙末，過0.425 mm（40目）篩。準(zhǔn)確稱取煙末1.0 g，置于20 mL 頂空瓶（配有聚四氟乙烯墊密封蓋）中，用微量注射器將α-紫羅蘭酮（內(nèi)標(biāo)，質(zhì)量濃度110μg/mL）滴在頂空瓶內(nèi)側(cè)，密封后置于固相微萃取加熱臺上平衡；將老化后的萃取頭插入頂空瓶中，頂空采樣一定時間；從頂空瓶中拔出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，在250 ℃下解吸10 min，進(jìn)行GC/MS 檢測。GC/MS 條件為：

色譜柱：HP-FFAP 石英毛細(xì)管（50 m×0.32 mm×0.50 μm）；載氣：高純氦氣，流速1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，先以10 ℃/min升至130 ℃，再以3 ℃/min 升至200 ℃，最后以5 ℃/min 升至230 ℃，保持20 min；離子源：EI 源；電離電壓：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；掃描方式：全掃描；掃描范圍：33～600 amu。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

在提取條件優(yōu)化數(shù)據(jù)分析中，對揮發(fā)性物質(zhì)的色譜峰進(jìn)行自動積分，得到不同條件下煙草揮發(fā)性物質(zhì)的色譜峰數(shù)量和總峰面積。為確保方法的可靠性，SPME arrow 提取條件優(yōu)化部分涉及的色譜峰數(shù)量均為化合物峰面積在平行樣品間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜30%的有效色譜峰。

經(jīng)過預(yù)實驗確認(rèn)，選擇試驗樣品中不存在且可與其他各組分完全分離的α-紫羅蘭酮為內(nèi)標(biāo)，采用相對峰面積（各組分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值）進(jìn)行分析。本研究中設(shè)置了質(zhì)控（QC）樣品，該樣品由試驗樣品等量混合而成，用于監(jiān)控整個試驗過程。用SIMCA-P13.0 軟件篩選出薩姆遜香突變體和對照中煙100 間的差異物質(zhì)。為消除成分間因含量差異較大而對樣本造成的影響，在數(shù)據(jù)導(dǎo)入前對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理。對于差異物質(zhì)的色譜峰，利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局化學(xué)數(shù)據(jù)庫（https：//webbook.nist.gov/chemistry/）的標(biāo)準(zhǔn)離子片段進(jìn)行檢索，結(jié)合輔助保留指數(shù)（Retention index，RI）對比和文獻(xiàn)比對等人工解析方式，對差異物質(zhì)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPME arrow 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取頭種類的選擇

煙草中的揮發(fā)性物質(zhì)成分較為復(fù)雜，通常包括酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、酚類物質(zhì)等，因此極性和非極性萃取頭相結(jié)合更適合于此類復(fù)雜物質(zhì)的萃取。在基于常規(guī)SPME 方法的煙草揮發(fā)性物質(zhì)檢測中，CAR/PDMS 和DVB/CAR/PDMS 萃取頭較常用。向章敏等［10］選擇PDMS/DVB/CAR 萃取頭進(jìn)行了煙草揮發(fā)性生物堿分析。楊瓊等［11］選擇CAR/PDMS 萃取頭對煙氣中揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分進(jìn)行了測定。Tae 等［12］采用SPME arrow 進(jìn)行糙米醋中揮發(fā)物分析時，發(fā)現(xiàn)CAR/PDMS 的萃取效果優(yōu)于其他幾種萃取頭。

本 研 究 中 選 擇PDMS、DVB/PDMS、CAR/PDMS 和DVB/CAR/PDMS 4 種萃取頭進(jìn)行測試，比較了不同材質(zhì)萃取頭對烤后煙葉揮發(fā)性香氣成分選擇性和重現(xiàn)性的影響。從圖1 可以看出，不同吸附涂層的纖維頭對煙葉揮發(fā)性香氣成分的分析結(jié)果影響較大，4 種萃取頭中CAR/PDMS 萃取頭的色譜峰數(shù)量和總峰面積都明顯高于其他3 種萃取頭?？梢?，CAR/PDMS 在煙草揮發(fā)性物質(zhì)檢測中萃取物質(zhì)種類多，靈敏度高。因此，選擇CAR/PDMS 為吸附萃取頭。

圖1 4 種SPME arrow 的萃取效果比較Fig.1 Comparison of extraction effects among four SPME arrows

2.1.2 平衡時間的確定

平衡時間不僅可以決定揮發(fā)性成分和樣品之間的兩相平衡效果，還影響萃取頭的吸附量和達(dá)到吸附平衡的時間［13］。為進(jìn)一步優(yōu)化SPME arrow的平衡時間，選擇萃取效果較好的CAR/PDMS 作為吸附萃取頭，固定萃取時間為30 min，萃取溫度為70 ℃，考察了平衡時間（10、20、30、40、50、60、70 min）對萃取效果的影響。結(jié)果（圖2）顯示，當(dāng)平衡時間達(dá)到40 min 時，色譜峰數(shù)量和總峰面積趨于穩(wěn)定，再延長平衡時間二者變化不大，因此確定平衡時間40 min。

圖2 不同平衡時間的萃取效果比較Fig.2 Comparison of extraction effects at different equilibrium times

2.1.3 萃取時間的確定

為進(jìn)一步優(yōu)化SPME arrow 的萃取時間，固定CAR/PDMS 為吸附萃取頭，平衡時間為40 min，萃取溫度為70 ℃，考察了萃取時間（10、20、30、40、50、60、70 min）對萃取效果的影響。由圖3 可知，隨著萃取時間的延長，色譜峰數(shù)量和總峰面積也隨之增大，在40 min 后趨于平緩，說明物質(zhì)吸附和脫附之間達(dá)到平衡。當(dāng)萃取時間為70 min 時，總峰面積略有下降，這可能是因為萃取頭涂層吸附已經(jīng)趨于飽和，萃取時間過長會導(dǎo)致熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)分解或者少量易揮發(fā)性組分逸出，進(jìn)而造成物質(zhì)損失，使總峰面積減小。因此，確定萃取時間為40 min。

圖3 不同萃取時間的萃取效果比較Fig.3 Comparison of extraction effects at different extraction time

2.1.4 萃取溫度的選擇

萃取溫度的高低直接影響目標(biāo)物的吸附效果［14］。溫度過低會使平衡時間變長，萃取的揮發(fā)性成分的數(shù)量和種類也較少。當(dāng)溫度升高時，揮發(fā)出來的物質(zhì)種類和數(shù)量增加，但是溫度過高時，一方面，會導(dǎo)致平衡蒸汽壓增大，分子熱運(yùn)動加快，吸附平衡系數(shù)降低，物質(zhì)吸附量減少［15］，另一方面，會使萃取頭上熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)發(fā)生解析，吸附量減少。Feng 等［16］研究表明，低分子量的揮發(fā)性物質(zhì)，包括乙醇和乙酸乙酯，由于分配系數(shù)較低，在較高溫度下峰面積較小。另外，當(dāng)溫度超過100 ℃時，煙末中的糖類物質(zhì)和氨基酸之間會發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成其他產(chǎn)物［17］，影響定性分析結(jié)果。因此，在煙草揮發(fā)性物質(zhì)分析中，萃取溫度一般都不超過100 ℃。

為進(jìn)一步優(yōu)化SPME arrow 的萃取溫度，固定CAR/PDMS 為吸附萃取頭，平衡時間為40 min，萃取時間為40 min，考察了萃取溫度（40、50、60、70、80、90、100 ℃）對萃取效果的影響。結(jié)果（圖4）顯示，隨著溫度的升高，總峰面積不斷增加，但有效色譜峰數(shù)量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在溫度升至70 ℃后不斷降低，說明溫度超過70 ℃后，揮發(fā)性物質(zhì)不穩(wěn)定，樣品間重現(xiàn)性變差。綜合考慮，選擇萃取溫度為70 ℃。

2.2 方法學(xué)評價

HS-SPME arrow-GC/MS 測定和多元統(tǒng)計分析中，重現(xiàn)性為方法穩(wěn)定性的主要考察指標(biāo)之一。連續(xù)6 d，采用優(yōu)化的方法檢測QC 樣品，對方法的重現(xiàn)性進(jìn)行考察。從QC 樣品中共檢測到178個色譜峰。所有色譜峰保留時間的相對偏差均在±0.03 min 內(nèi)，說明保留時間穩(wěn)定，有利于自動積分。在178 個色譜峰中，峰面積RSD＜10%、10%～20%、20%～30%的色譜峰個數(shù)分別為74、62 和23個。159 種化合物色譜峰相對峰面積的RSD＜30%，占色譜峰總數(shù)量的89.3%。

圖4 不同萃取溫度的萃取效果比較Fig.4 Comparison of extraction effects at different extraction temperatures

2.3 煙草香氣突變體特征香氣成分解析

2.3.1 香氣成分PCA 分析

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P13.0 軟件，變量經(jīng)Par-scaling 標(biāo)度化處理后，采用非監(jiān)督模式識別方法（PCA）觀察各樣本的總體分布情況。PCA 可以盡可能多地反映變量的原始信息，直觀顯示不同樣本之間的整體差異，從得分圖（圖5）可以看出，QC 樣本緊密聚集，說明試驗過程中，檢測方法和儀器狀態(tài)穩(wěn)定，對結(jié)果影響較小。薩姆遜香突變體與中煙100 可以自然聚集為兩類，說明兩個樣品間香氣物質(zhì)存在一定差異。

圖5 香氣成分PCA 得分圖Fig.5 PCA score plot of aroma components

2.3.2 香氣成分PLS-DA 分析及特征香氣成分解析

為進(jìn)一步研究薩姆遜香煙草突變體與對照中煙100 之間香氣成分的差異，采用有監(jiān)督的模式識別方法最小二乘判別分析（PLS-DA），對兩個材料煙葉的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析，分析結(jié)果見圖6。由圖6 可以看出，兩組樣品聚類良好，可顯著分離。結(jié)合評價PLS-DA 模型質(zhì)量的3 個關(guān)鍵指標(biāo)可知，R2X=0.691，R2Y=0.991，Q2=0.966，說明模型的穩(wěn)定性和預(yù)測性較好。此外，為了驗證模型是否存在過擬合現(xiàn)象，本研究中還對模型進(jìn)行了200次響應(yīng)排序（圖7）。排列實驗中左端任何一次隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2、Q2值均小于右端的原始值，Q2截距值等于或小于0，則表明模型有效。由圖7 可知，R2和Q2的截距分別為0.614 和-0.146，說明模型有效，不存在過擬合現(xiàn)象。

圖6 香氣成分PLS-DA 得分圖Fig.6 PLS-DA score plot of aroma components

圖7 PLS-DA 模型200 次交叉檢驗驗證圖Fig.7 Cross-validation plot of PLS-DA with 200 permutation tests

表1 薩姆遜香突變體和中煙100 的差異揮發(fā)性成分Tab.1 Differential volatile compounds between Samson and ZY100

采用變量權(quán)重重要性排序（Variable Importance in Projection，VIP），結(jié)合T-檢驗的P值（閾值為0.05），對PLS-DA 模型中差異性較大的代謝物進(jìn)行篩選。以VIP＞1.0 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選了對模型分類貢獻(xiàn)較大的33 個變量（表1）。VIP 值越大，說明香氣成分在兩個樣本間的差異越顯著。差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）為香氣成分在薩姆遜香突變體和中煙100 中相對含量的比值，P值由T-檢驗獲得。由表1 可知，33 種差異代謝物中包含酮類10種，酸類7 種，醇類4 種，醛類3 種，酯類2 種，其他類別化合物7 種。其中，薩姆遜香材料中絕大部分物質(zhì)的含量高于中煙100，中煙100 中僅有4 種化合物（乙酸、苯甲醛、十六酸甲酯、二烯煙堿）的含量高于薩姆遜香突變體。

薩姆遜香突變體具有明顯的香料煙特征香韻，煙葉具有濃郁芳香、吃味醇和等特點。研究表明，香料煙的揮發(fā)性有機(jī)酸對煙葉的香氣貢獻(xiàn)較大［18］，香料煙中β-甲基戊酸、戊酸和異戊酸的含量比烤煙中高，其香氣強(qiáng)度明顯高于其他揮發(fā)性有機(jī)酸，而甲酸和乙酸的含量則相對較低［19］。本研究中篩選出7 種差異顯著的有機(jī)酸，其中，乙酸含量降低，而β-甲基戊酸、戊酸、己酸等6 種有機(jī)酸的含量均升高，這與香料煙的特性相符合。在酮類揮發(fā)性香氣成分中，茄酮、降茄二酮、β-二氫大馬酮和β-大馬酮等重要香氣物質(zhì)的含量顯著升高。茄酮及其降解產(chǎn)物降茄二酮是煙草重要的香味物質(zhì)，其香氣與煙香協(xié)調(diào)，可賦予煙氣類似胡蘿卜的香味以及甘草香和茶香，在提高卷煙香氣質(zhì)、香氣量等方面發(fā)揮著重要作用［20］。薩姆遜香材料中β-大馬酮含量是中煙100 的4.78 倍，β-大馬酮是類胡蘿卜素的主要降解產(chǎn)物，屬于中性致香物質(zhì)［21］。苯甲醛和糠醛是煙草中兩種重要的醛類香氣物質(zhì)，二者分別屬于苯丙氨酸類代謝產(chǎn)物和棕色化反應(yīng)產(chǎn)物，與中煙100 相比，薩姆遜香突變體中苯甲醛含量極顯著降低，而糠醛含量極顯著增加，這與常愛霞等［21］對烤煙和香料煙中揮發(fā)性致香物質(zhì)的研究結(jié)果一致。此外，與對照中煙100 相比，薩姆遜香突變體中4 種醇類物質(zhì)（5-甲基-2-呋喃甲醇、8-羥基芳樟醇、苯甲醇和環(huán)己醇）的含量均極顯著增加。可見，薩姆遜香突變體煙葉中香氣物質(zhì)的組成、含量及各組分之間的平衡協(xié)調(diào)性綜合影響了煙葉的香氣特征。

表1（續(xù)）

3 結(jié)論

通過對影響SPME arrow 萃取效率的4 個主要因素（萃取頭涂層種類、平衡時間、萃取時間和萃取溫度）進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種基于HS-SPME arrow-GC/MS 測定煙草揮發(fā)性香氣成分的方法。本方法具有簡單、可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性較好等特點，可用于批量樣品的檢測與分析，尤其適合于低分子量揮發(fā)性香氣成分的分析。將本方法與化學(xué)計量學(xué)相結(jié)合，分析了薩姆遜香突變體和中煙100 煙葉中香氣成分的差異，從兩個材料中鑒定出包括酮類、酸類、醇類、醛類、酯類物質(zhì)等33 種差異香氣組分。兩種不同香氣特征的煙葉在模型中實現(xiàn)了顯著分離，香氣成分差異顯著。