煙草查爾酮異構(gòu)酶基因2（NtCHI2）功能分析

翟 妞，鄭慶霞，劉萍萍，徐國(guó)云，張 慧，李 晶，陳千思，武明珠，周會(huì)娜*

1. 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001 2. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市五華區(qū)科醫(yī)路41 號(hào) 650106

黃酮類化合物是一種小分子酚類物質(zhì)，是植物次生代謝的主要產(chǎn)物之一，具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、保護(hù)植物免受紫外線損傷、抗病蟲(chóng)、抗氧化等功能［1-2］。煙草黃酮類化合物不僅對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，該類化合物，尤其是其中的蕓香苷含量對(duì)煙葉品質(zhì)有直接影響［3-4］。目前黃酮類化合物的代謝途徑相對(duì)清楚，黃酮類代謝起始于苯丙烷代謝，由查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）引向黃酮類合成［5-6］。查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）是黃酮類合成代謝的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)酶［7］，在黃酮類物質(zhì)的代謝通路中催化查爾酮柚（苷）配基4，5，7-三羥黃烷酮轉(zhuǎn)化合成柚（苷）配基4，5，7-三羥黃烷酮（異黃酮的前體），由此進(jìn)入異黃酮代謝支路［8-9］，蕓香苷就是此支路的產(chǎn)物。賈宏昉等［10］的研究表明，CHI基因在不同生態(tài)區(qū)濃香型烤煙中的表達(dá)差異明顯，提示其可能在黃酮類物質(zhì)形成中起關(guān)鍵作用。栽培煙草中的CHI基因有2 個(gè)拷貝，即NtCHI1和NtCHI2，NtCHI1的功能已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)［11］，NtCHI2的功能還未見(jiàn)報(bào)道。

本課題組前期多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，鮮煙葉中蕓香苷的含量與NtCHI2正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.72。本研究中以NtCHI2過(guò)表達(dá)和干擾株系為研究對(duì)象，通過(guò)qPCR 定量分析基因NtCHI2的表達(dá)，進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)體外查爾酮異構(gòu)酶活性分析和體內(nèi)蕓香苷含量測(cè)定，驗(yàn)證NtCHI2基因的功能，為蕓香苷的合成代謝調(diào)控提供新靶標(biāo)，也為創(chuàng)制新型煙草材料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 煙草材料

NtCHI2（Ntab0103790.1）過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（CHI-1、CHI-2、CHI-3）和干擾株系（RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3、RNAi-4、RNAi-5）為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，對(duì)照株系（CK）為K326，溫室培育；8～10 葉期時(shí)，采集第4 片葉，立即液氮冷凍，-80 ℃保存。

1.1.2 試劑

RNApre pure 植物總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；第一鏈合成反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche 公司；熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master 購(gòu)自美國(guó)Roche 公司；蛋白定量試劑盒Pierce ? BCA Protein Assay Kit 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；查爾酮異構(gòu)酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物科技有限公司；引物由擎科生物（鄭州）工程有限責(zé)任公司合成；其他常規(guī)試劑均為購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司的分析純?cè)噭?。蛋白提取NE 緩沖液，實(shí)驗(yàn)室自配（20 mmol/L Hepes（pH 7.5），40 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF）。甲酸、乙腈、無(wú)水乙醇（色譜純，美國(guó)Merck 公司）；標(biāo)準(zhǔn)品（山奈酚、綠原酸、東莨菪亭、東莨菪苷、花青素鼠李糖苷、蕓香苷、山奈酚-3-糖、槲皮素和鼠李金）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.1.3 儀器

PL-602L 和MS105 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、PURELAB Pulse 超純水一體化系統(tǒng)（英國(guó)ELGA 公司）、FRESCO 21 冷凍臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）、Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司）、PCR System 9700 熱循環(huán)儀（美國(guó)AB 公司）、MK2000-2E 恒溫金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司）、LightCycler?96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Roche 公司）、Spectra Max plus 384 酶標(biāo)儀（美國(guó)MD 公司）、1290/6490 超高效液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）、25 EL5 冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Genesis公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙草葉片RNA 提取及cDNA 制備

將煙葉樣品在液氮中充分研磨后，取10 mg 粉末，參考張慧等［12］的方法進(jìn)行RNA 的提取和cDNA 的制備。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

qPCR 反 應(yīng) 條 件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，55 ℃10 s，72 ℃10 s，共40 個(gè) 循 環(huán)；95 ℃5 s，65 ℃1 min，以0.1 ℃/s 升溫至97 ℃。

以β-actin為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因和目的基因各重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值表示。每個(gè)樣品組的目的基因NtCHI2/內(nèi)參基因β-actin的比值代表基因的表達(dá)水平變化。內(nèi)參基因β-actin，正向引物：5'-CT GGCATTGCAGATCGTATA-3'；反向引物：5'-GCGCC ACCACCTTGATCTT-3'。目的基因NtCHI2，正向引物：5'-GATTCAATTACTGGCACTC-3'；反向引物：5'-TCGGCGATACTACACTTT-3'。具體qPCR擴(kuò)增體系及計(jì)算參考張慧等［12］的方法。

1.2.3 煙草葉片總蛋白提取及定量

1.2.3.1 蛋白提取

將采集的煙葉樣品在液氮中充分研磨，稱取100 mg 粉末，加入1 mL 全蛋白提取緩沖液NE；參考翟妞等［13］的方法進(jìn)行煙葉全蛋白的提取。

1.2.3.2 蛋白定量

取上清液，稀釋10 倍，按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)量（μg），除以樣品稀釋液總體積并乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度（μg/μL）。

1.2.4 查爾酮異構(gòu)酶活性檢測(cè)

每個(gè)株系采集第4 葉位葉片，按照查爾酮異構(gòu)酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。3 次重復(fù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。

查爾酮異構(gòu)酶活性（U/μg 全蛋白）=樣品的活性濃度×上樣體積/上樣蛋白總量

1.2.5 查爾酮異構(gòu)酶體外表達(dá)活性檢測(cè)

利用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的體外表達(dá)質(zhì)粒pQE30-NtCHI2，轉(zhuǎn)化BL21 細(xì)胞，挑取單克隆菌斑置入150 mL 錐形瓶中，37 ℃180 r/min 恒溫培養(yǎng)，至OD 值為0.6～1.0 時(shí)，0.5 mol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，37℃180 r/min 恒溫培養(yǎng)3 h。收集菌液，4 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清液，加入蛋白裂解液RIPA 5 mL，混勻后冰上超聲提取，13 000 r/min 離心15 min，取上清液，利用1.2.4 節(jié)的方法進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.2.6 蕓香苷含量檢測(cè)

取煙葉凍干粉末20 mg 于2 mL 離心管中，加入1.5 mL 提取液（75%甲醇溶液，含內(nèi)標(biāo)傘形花內(nèi)酯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5 mg/mL），渦旋6 s后超聲提取1 h后，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，參考劉萍萍等［14］的方法測(cè)定蕓香苷含量。6 次檢測(cè)重復(fù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行T-test 差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 查爾酮異構(gòu)酶基因過(guò)表達(dá)株系和干擾株系中NtCHI2 的表達(dá)量

對(duì)實(shí)驗(yàn)室培育的NtCHI2過(guò)表達(dá)株系和干擾株系的葉片樣品進(jìn)行定量分析，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)：和對(duì)照株系比，過(guò)表達(dá)株系中NtCHI2的表達(dá)量增加5 倍至75 倍（圖1a），基因表達(dá)上調(diào)顯著；和對(duì)照株系比，干擾株系中NtCHI2的表達(dá)量下降約30%～70%（圖1b），基因表達(dá)下調(diào)極顯著。

圖1 NtCHI2 在過(guò)表達(dá)株系（a）和干擾株系（b）中的表達(dá)差異Fig.1 Relative expression levels of NtCHI2 in NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

2.2 查爾酮異構(gòu)酶基因過(guò)表達(dá)株系和干擾株系中CHI 的活性

對(duì)NtCHI2過(guò)表達(dá)株系和干擾株系的葉片樣品在基因定量的基礎(chǔ)上，進(jìn)行CHI 的酶活檢測(cè)。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照株系比，NtCHI2過(guò)表達(dá)株系中CHI 酶的活性沒(méi)有顯著差異（圖2a），而干擾株系中CHI 酶的活性顯著降低，各株系分別降低34.2%、57.6%、46.8%、51.4%和61.6%（圖2b）。說(shuō)明在煙草中過(guò)表達(dá)NtCHI2對(duì)CHI 酶活的影響不大，而降低NtCHI2基因表達(dá)量則會(huì)顯著降低CHI酶的活性。

圖2 NtCHI2 過(guò)表達(dá)株系（a）和干擾株系（b）中CHI 的活性差異Fig.2 CHI activities of NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

2.3 體外表達(dá)查爾酮異構(gòu)酶的活性

通過(guò)構(gòu)建好的表達(dá)菌株pQE30-CHI2/BL21 誘導(dǎo)表達(dá)CHI2 蛋白，提取全蛋白進(jìn)行CHI 酶活性檢測(cè)。結(jié)果（圖3）表明：體外表達(dá)CHI2 的酶活性為1.4×10-4U·μg-1全蛋白，而空載體對(duì)照幾乎為零。說(shuō)明煙草NtCHI2的表達(dá)產(chǎn)物具有CHI 酶活性。

圖3 NtCHI2 表達(dá)菌株中CHI 酶的活性Fig.3 CHI activity of strains with NtCHI2 expression

2.4 查爾酮異構(gòu)酶基因過(guò)表達(dá)株系和干擾株系中蕓香苷含量

對(duì)實(shí)驗(yàn)室培育的NtCHI2過(guò)表達(dá)株系和干擾株系的葉片樣品在基因定量和酶活性檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行蕓香苷含量檢測(cè)。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)：和對(duì)照株系比，NtCHI2過(guò)表達(dá)株系中蕓香苷的含量變化不明顯（圖4a），而干擾株系中蕓香苷的含量顯著降低，不同株系可分別降低90.5%、72.4%、91.3%、88.8%和85.4%（圖4b）。說(shuō)明干擾株系中，NtCHI2的表達(dá)量降低，對(duì)應(yīng)的CHI 酶的活性也隨之降低，影響了后續(xù)的黃酮類化合物蕓香苷的代謝。

圖4 NtCHI2 過(guò)表達(dá)株系（a）和干擾株系（b）中蕓香苷的含量差異Fig.4 Rutin contents in NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)NtCHI2的表達(dá)量與鮮煙葉中蕓香苷的含量正相關(guān)。但是與NtCHI1比，NtCHI2過(guò)表達(dá)株系中，CHI 活性和蕓香苷含量沒(méi)有變化，不過(guò)體外實(shí)驗(yàn)（圖3）表明NtCHI2的體外表達(dá)產(chǎn)物確實(shí)具有CHI 酶活性。

NtCHI2與NtCHI1功能的差異，可能由以下原因引起：①NtCHI1由603 個(gè)核苷酸組成，NtCHI2由768 個(gè)核苷酸組成，均含有4 個(gè)外顯子，NtCHI23'端 比NtCHI13' 端 多165 個(gè) 核 苷 酸；②NtCHI1 由200 個(gè)氨基酸組成，NtCHI2 由255 個(gè)氨基酸組成，NtCHI2 C 端比NtCHI1C 端多55 個(gè)氨基酸；③搜索中 國(guó) 煙 草 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//10.6.0.76/）中NtCHI1 和NtCHI2 的結(jié)構(gòu)信息，NtCHI1 的活性功能域?yàn)?～199 位的氨基酸，NtCHI2 的活性功能域?yàn)?～206 位的氨基酸，NtCHI2 比NtCHI1 多7 個(gè)氨基酸，為T(mén)IPEIGV。NtCHI2過(guò)表達(dá)株系中，CHI 活性沒(méi)變化，應(yīng)該和其結(jié)構(gòu)域中多出的7 個(gè)氨基酸有關(guān)。NtCHI2翻譯后的氨基酸修飾，抑制其CHI活性，與蕓香苷引發(fā)的反饋抑制無(wú)關(guān)，因?yàn)槭|香苷的含量并沒(méi)有增多。但具體是哪個(gè)氨基酸被修飾引起的NtCHI2 酶活性被抑制，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

對(duì)NtCHI2功能的進(jìn)一步驗(yàn)證，確定其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域中起關(guān)鍵作用的氨基酸，可以為后續(xù)通過(guò)分子手段干擾、定點(diǎn)突變等調(diào)控蕓香苷代謝提供精確靶點(diǎn)。對(duì)比其他通過(guò)栽培手段提高CHI 酶活性［15］或者利用轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄等［16-19］調(diào)控類黃酮代謝技術(shù)，通過(guò)分子手段對(duì)類黃酮代謝關(guān)鍵酶CHI 的活性進(jìn)行靶向調(diào)控更為直接，效果也可能更好。

4 結(jié)論

NtCHI2表達(dá)蛋白具有查爾酮異構(gòu)酶活性；過(guò)表達(dá)株系中，NtCHI2表達(dá)量明顯增加，但CHI 酶的活性和蕓香苷的含量基本沒(méi)有變化；NtCHI2干擾株系中，NtCHI2表達(dá)量顯著降低，CHI 酶的活性和蕓香苷含量也顯著降低。因此，NtCHI2基因表達(dá)量與煙葉蕓香苷含量具有一定的正相關(guān)關(guān)系，可通過(guò)抑制NtCHI2基因的表達(dá)進(jìn)而提高煙葉中蕓香苷的含量。