高效液相色譜法測(cè)定醬油中苯甲酸的不確定度評(píng)定*

馬義虔，陳學(xué)航，肖 洋，李清偉，張建剛

(貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 貴陽(yáng) 550016)

不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的非負(fù)參數(shù)(包括A類和B類不確定度)。A類可由貝塞爾公式法和極差法進(jìn)行評(píng)定，B類可根據(jù)有關(guān)的信息或經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)定[1-3]。不確定度數(shù)值的大小反映了測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的高低。數(shù)值越小，所測(cè)結(jié)果與被測(cè)量的真值越接近，其使用價(jià)值就越高。在食品與化學(xué)分析、檢測(cè)領(lǐng)域，評(píng)定不確定度既是提高分析檢測(cè)質(zhì)量的需要，也是實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果國(guó)內(nèi)外互認(rèn)所不可缺少的內(nèi)容。苯甲酸是一種常用的食品防腐劑，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014[4]規(guī)定了醬油中苯甲酸的最大使用量為1.0 g/kg。已有研究者評(píng)定了醬油、果汁泥和橘子汁中苯甲酸和山梨酸[5-8]不確定度，一方面未將不確定度的分量`考慮完整，另一方面不確定度有效位數(shù)保留不符合JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》規(guī)定，如果汁泥中苯甲酸含量為(5.997±0.746) μg/kg(k=2)[8]。本研究根據(jù)JJF 1059.1-2012[2]和JJF 1135-2005[3]，通過(guò)GB 5009.28-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》測(cè)定方法[9]評(píng)定醬油中苯甲酸的不確定度，以期為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、能力驗(yàn)證以及向社會(huì)出具官方檢測(cè)報(bào)告提供科學(xué)、準(zhǔn)確的根據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀(DAD)，美國(guó)Agilent公司；ME204E/02分析天平，瑞士Mettler公司；Allegra X-22R冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；SB25-12DTS超聲波清洗機(jī)，寧波新芝公司。

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度1 mg/mL)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨為優(yōu)級(jí)純，麥克林公司；甲醇、乙腈均為色譜純，德國(guó)Merck公司；醬油為市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，樣品前處理方法和色譜條件見GB 5009.28-2016[9]。

1.3 不確定度來(lái)源分析

1.3.1 不確定度模型

醬油中苯甲酸含量計(jì)算公式如下：

(1)

式中：X樣品中苯甲酸含量，g/kg；C樣品中苯甲酸的質(zhì)量濃度，mg/L；V樣品定容體積，mL；m樣品質(zhì)量，g；1000為mg/kg轉(zhuǎn)換為g/kg的換算因子。

1.3.2 不確定度來(lái)源確定

圖1 高效液相色譜測(cè)定醬油中苯甲酸的不確定度來(lái)源Fig.1 Uncertainty source for determination of benzoic acid in soy sauce with HPLC

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量重復(fù)性的不確定度

測(cè)量重復(fù)性的不確定度可通過(guò)樣品重復(fù)進(jìn)樣來(lái)計(jì)算，屬于A類不確定度評(píng)定。對(duì)醬油中苯甲酸進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果及不確定度見表1。

表1 醬油中苯甲酸重復(fù)測(cè)定結(jié)果及不確定度Table 1 Repeated determination of benzoic acid in soy sauce and its uncertainty

2.2 樣品稱量的不確定度μ(m)

天平重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(2)

天平示值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(3)

則樣品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(4)

2.3 樣品溶液定容體積的不確定度μ(V)

樣品溶液定容體積的不確定度有：容量瓶允許差和溫度效應(yīng)。

2.3.1 容量瓶允許差的不確定度μ(V1)

(5)

2.3.2 溫度效應(yīng)的不確定度μ(T1)

(6)

則樣品溶液定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(7)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制的不確定度μ(std)

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制的不確定度有兩個(gè)部分：標(biāo)準(zhǔn)品和配制中量器(移液器允許差、容量瓶允許差和溫度效應(yīng))。

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel(std)

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，根據(jù)證書提供的信息，相對(duì)擴(kuò)展不確定度U=2%，K=2。因此，苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(8)

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制中量器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度μ(V2)

(9)

(10)

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制中量器的不確定度如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制中量器的不確定度結(jié)果Table 2 Uncertainty results by the measurer in standard series solution preparation

則由標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(11)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度μ(C)

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度可通過(guò)HPLC依次測(cè)定1、5、10、20、50、100、200 mg/L的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度-峰面積，得到峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的線性方程，測(cè)定結(jié)果和不確定度見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)曲線擬合的不確定度Table 3 Uncertainty results introduced standard curve fitting

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度可按(12)和(13)式計(jì)算：

(12)

(13)

2.6 回收率的不確定度μ(Rec)

受人員操作、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等因素影響，樣品經(jīng)處理后目標(biāo)物苯甲酸會(huì)有一定損失。采用高、中、低3個(gè)水平添加苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行3次測(cè)定，根據(jù)9次結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，回收率結(jié)果見表4。

表4 回收率測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of recovery

回收率的不確定度屬于A類不確定度評(píng)定，n=9，則回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(14)

2.7 液相色譜儀測(cè)定的不確定度μ(Dete)

(15)

2.8 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度來(lái)源和各分量結(jié)果見表5。

表5 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量Table 5 List of relative standard uncertainties

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.01922

(16)

2.9 不確定度報(bào)告及結(jié)果表示

表6 醬油中苯甲酸的不確定度評(píng)定報(bào)告Table 6 Uncertainty evaluation for the determination of benzoic acid in soy sauce

3 結(jié) 論

完整的測(cè)量數(shù)據(jù)應(yīng)包括不確定度信息。不確定度測(cè)量可提供分析測(cè)定過(guò)程中誤差來(lái)源。本文根據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和JJF 1135-2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》標(biāo)準(zhǔn)和不確定度文獻(xiàn)，結(jié)合本研究采用高效液相色譜法測(cè)定醬油中苯甲酸的不確定度評(píng)定，按照實(shí)驗(yàn)順序依次篩選出不確定度的來(lái)源包括測(cè)量重復(fù)性、稱量、定容、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、液相色譜測(cè)定等過(guò)程。根據(jù)計(jì)算出各步驟的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量值，可得知標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制產(chǎn)生的不確定貢獻(xiàn)最大，與寧宵等[12]、曹玲等[13]和潘城等[14]研究結(jié)果一致，其次是回收率和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。因此，在實(shí)際操作過(guò)程中，應(yīng)選擇準(zhǔn)確度等級(jí)較高的標(biāo)準(zhǔn)品和量器(玻璃量器和移液器)來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，使樣品濃度介于第二和第三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)之間；保持高效液相色譜儀器較高的靈敏度；增加標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和樣品的測(cè)定次數(shù)；提高操作人員的分析測(cè)量水平以減小測(cè)量不確定度，從而提高數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。