虎杖膏HPLC指紋圖譜研究

陳婷婷，歐水平，陳忠靜，王 森，王玉和

(1.遵義醫(yī)科大學 藥學院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099)

虎杖膏是將虎杖細粉、冰片、固體石蠟和麻油組成的一種油膏劑，是外科、皮膚科常用的中藥外用制劑，由遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院自主研發(fā)制成。對于紅腫而未潰爛的瘡、癰、疔、癤以及軟組織損傷、痛風等有很好的治療效果，在院內(nèi)使用多年，療效明顯[1-5]。該制劑的君藥是虎杖，屬于蓼科蓼屬植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc)的干燥莖和根，其性質(zhì)微寒、味道微苦，歸屬于肝、膽、肺經(jīng)。具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛等功效[6-8]?；⒄戎饕邪邹继J醇和虎杖苷等二苯乙烯類和大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等蒽醌類化學成分[9-13]?；⒄群械幕钚猿煞侄?、質(zhì)量控制難度大。趙萍等采用HPLC測定了虎杖膏中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚4種成分的含量[14]，劉慧文[15]、袁萍[16]等做過虎杖的指紋圖譜研究，但目前尚未有關(guān)于虎杖膏的指紋圖譜報道。本研究擬建立虎杖膏的HPLC指紋圖譜，以為該制劑全面有效的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1260 HPLC儀，含DAD檢測器(美國Agilent公司)；BT125D電子天平(德國Sartorius公司)； ME204E電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Exceed-Cd-20型實驗室超純水機(成都艾科水處理設(shè)備有限公司)；HH-S6二列方孔水浴(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；TD5A-WA型離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 試藥 虎杖膏[遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑科自制，批號：20171229、20180118、20180119、20180124、20180125、20180213、20180320、20180321、20180327、20180328、20180816、20180823、20180828，(S1-S13)規(guī)格：40 g/盒]；虎杖苷對照品(批號：AF8071101，純度：99.87 %)、大黃素對照品(批號：AF7021741，純度：98.89 %)、蘆薈大黃素對照品(批號：AP7112011，純度：98.57 %)、白藜蘆醇(批號AP7091921，純度：99.88 %)、大黃素甲醚(批號：AP7081509，純度：99.85 %)、大黃酸(批號：AP8041804，純度：99.49 %)、大黃素-8-葡萄糖苷(批號：PRF9050423，純度：97.00 %)，均購自成都埃法生物科技有限公司；色譜級乙腈，購自瑞典歐森巴克化學公司；重蒸水，其他試劑均使用AR級試劑。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件[14]色譜柱：Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1 %磷酸水溶液，梯度洗脫程序：0～15 min：乙腈15 %～20 %，15～25 min：乙腈20 %～30 %，25～40 min：乙腈30 %～50 %，40～41 min：乙腈50 %～70 %，41～51 min：乙腈70 %～80 %，51～60 min：乙腈80 %；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm；柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

1.3.2 虎杖膏的制備 參考文獻方法制備[1]，按40 g/盒規(guī)格分裝，冷卻至室溫，即得虎杖膏樣品。

1.3.3 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素及大黃素甲醚對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加65 %乙醇稀釋定容，得到各單個對照品母液，從各對照品母液中各取1 mL到10 mL容量瓶中，用65 %乙醇稀釋定容，制成每1 mL分別含虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素及大黃素甲醚59.5、6.2、21.6、31.0、31.0、30.2、30.0 μg的混合對照品溶液。

1.3.4 供試品溶液的制備 稱取虎杖膏5 g，進行脫脂處理，精密稱取脫脂后的虎杖膏0.1 g，加65 %乙醇30 mL， 超聲處理20 min(功率50 Hz)，2 000 rpm離心10 min，精密吸取上清液2.5 mL，加65 %乙醇定容至10 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗 取一份“1.3.4”項制備的供試品溶液，進行6次連續(xù)測定，得到供試品溶液HPLC圖。以虎杖苷的保留時間和峰面積為參照，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，20個共有峰的相對保留時間的RSD為1.21 %～1.24 %(n=6)，相對峰面積RSD 為2.38 %～2.97 %(n=6)。表明儀器精密度良好。

2.2 穩(wěn)定性試驗 取“1.3.4”項制備的同一供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、24 h進樣測定。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間的RSD為1.21 %～1.25 %(n=6)，相對峰面積RSD范圍為1.79 %～2.63 %(n=6)。說明供試品溶液的穩(wěn)定性良好，在24 h內(nèi)趨于穩(wěn)定。

2.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一供試品溶液，共6份，再按“1.3.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果表明，20個共有峰的相對保留時間的RSD為1.20 %～1.22 %(n=6)，相對峰面積RSD 為2.27 %～2.89 %(n=6)，表明供試品處理方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 參照峰的選擇 在HPLC圖譜中，3號峰分離度良好，峰面積穩(wěn)定，經(jīng)與對照品對照為虎杖苷。故選擇其為參照峰(見圖1)。

A：混合對照品；B：樣品溶液；C：空白對照；D：陰性對照圖；3.虎杖苷；6.白藜蘆醇；8.大黃素-8-葡萄糖苷；15.蘆薈大黃素；16.大黃酸；17.大黃素；20.大黃素甲醚。圖1 HPLC圖

2.4.2 HPLC指紋圖譜的生成 用13個批次虎杖膏樣品適量，按“1.3.4”項下方法制備供試品溶液，再按色譜條件進樣測定。依據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)比對分析13批虎杖膏樣品所測出的HPLC圖譜。以S1樣品為參照圖譜，多點校正后自動匹配，生成對照圖譜(R)，13批樣品含有20個共有峰，詳見圖2。

圖2 13批虎杖膏樣品的指紋圖譜

2.4.3 相似度分析 根據(jù)2012版指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)生成13批虎杖膏指紋圖譜共有模式，經(jīng)色譜峰自動匹配，對13批樣品的HPLC圖譜進行比較分析以及整體相似性評價。結(jié)果，13批虎杖膏樣品(S1～S13)相似度范圍為0.953～0.992，表明13批樣品質(zhì)量穩(wěn)定，詳見表1。

表1 13批虎杖膏樣品相似度評價結(jié)果

2.4.4 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 依據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版)，對13批虎杖膏樣品所測出的HPLC圖譜進行比對分析。結(jié)果，13批樣品有20個共有峰。指認了7個共有峰，分別為虎杖苷(3號峰)、白藜蘆醇(6號峰)、大黃素-8-葡萄糖苷(8號峰)、蘆薈大黃素(15號峰)、大黃酸(16號峰)、大黃素(17號峰)、大黃素甲醚(20號峰)。計算其它共有峰相對于虎杖苷的相對保留時間和相對峰面積，詳見表2和表3。

表2 13批虎杖膏共有峰的相對保留時間

表3 13批虎杖膏共有峰的相對峰面積

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 本實驗參考了相關(guān)文獻中對虎杖相關(guān)成分的色譜條件和測定波長[14]，在286 nm波長處檢測到的色譜峰最多。色譜圖顯示基線平穩(wěn)，檢測限也能滿足各含量測定要求。且各峰的分離度和峰形均較好，因此選擇286 nm作為本實驗的最佳檢測波長。實驗中發(fā)現(xiàn)，所測溶液中的全部成分都在60 min之前出峰，之后沒有相關(guān)色譜峰出現(xiàn)。故此選擇60 min 作為檢測時間。

3.2 指紋圖譜相似度評價 選取13批2017年12月至2018年8月間制備的虎杖膏樣品，采用HPLC進行測定，以二苯乙烯類和蒽醌類成分作為評價指標，借助《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，創(chuàng)建虎杖膏HPLC色譜指紋圖譜及對照指紋圖譜。其分離度和重復(fù)性良好，為虎杖膏提供了質(zhì)量監(jiān)控手段。比較虎杖膏樣品指紋圖譜，可以看出收集來的13批虎杖膏指紋圖譜中共有20個共有峰，共有峰的整體圖貌基本一致。經(jīng)與對照品比較，確定了其中7個峰的歸屬，分別為虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃素甲醚。其中3號峰即虎杖苷分離度良好，峰面積穩(wěn)定，故選擇其作為參照峰。

通過對虎杖膏指紋圖譜的研究，13批虎杖膏樣品的相似度范圍為0.953～0.992，表明不同批次虎杖膏所含化學成分基本一致，所創(chuàng)建的指紋圖譜的技術(shù)指標穩(wěn)定、重復(fù)性較好，實驗方法簡便、快捷，能夠較好地反映虎杖膏中化學成分的特征，為深入研究虎杖膏活性成分的積累及變化規(guī)律，全面評價虎杖膏和其它含虎杖制劑的質(zhì)量提供了一種有效手段。