高效液相色譜法測(cè)定喉蛾散中鹽酸小檗堿含量

陳武軍

（福建省漳州市中醫(yī)院，福建 漳州 363000）

喉蛾散是由黃連、黃柏、桔梗、蜜甘草、琥珀、薄荷、硼砂、煅硼砂、珍珠、冰片、甘草、青黛、山豆根等中藥組方，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，適用于咽喉腫痛、口舌生瘡、牙齦腫疼等痰熱證。黃連、黃柏均有清熱燥濕、瀉火解毒功效，其主要活性成分為鹽酸小檗堿等多種生物堿，具有抗病毒、抗菌消炎、降血壓、降血糖、降低血清膽固醇、抗癌、抗心律失常、升白細(xì)胞、清熱解毒、利膽等生理活性［1］。為更有效控制喉蛾散的質(zhì)量，確?；颊哂盟幇踩行Э煽兀狙芯恐胁捎酶咝б合嗌V（HPLC）法對(duì)喉蛾散中黃連、黃柏所含活性成分鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括紫外檢測(cè)器，Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；TU-1900型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；ME104E型電子天平（精度為萬(wàn)分之一），XP26型電子天平（精度為百萬(wàn)分之一），均購(gòu)自梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713-201212，純度為86.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；喉蛾散（醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為 20190601，20190602，20190701）；乙腈為色譜純（美國(guó)Merk公司，批號(hào)為JB085530）；磷酸為色譜純（美國(guó)Fisher公司，批號(hào)為190900）；甲醇為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20190910）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Xridge RShield RP18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05% 磷酸溶液（B），梯度洗脫，詳見(jiàn)表 1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；流速：1 mL ／min；進(jìn)樣量：5 μL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)大于11 000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.2 溶液制備［2-3］

對(duì)照品溶液：取鹽酸小檗堿7.18 mg，精密稱(chēng)定，加70%乙醇溶解并定容至50 mL，制成每1 mL含鹽酸小檗堿143.60 μg的對(duì)照品母液。

供試品溶液：取樣品（批號(hào)為 20190602）0.2 g，精密稱(chēng)定，精密加入70%乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率為 250 W，頻率為 40 kHz）30 min，取出，放涼，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按喉蛾散處方和工藝制備缺黃連、黃柏陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察［4］

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間處有吸收峰，而缺黃連、黃柏的陰性對(duì)照品溶液在對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)吸收峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品母液1，3，5，7 mL，置 20，10，10，10 mL 容量瓶中，并分別用 70%乙醇溶劑并定容，搖勻，連同母液得系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝20 575X-2 715.7，R2＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在 7.18 ～143.60 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（71.80 μg ／mL）5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果的RSD為2.14%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20190602）樣品6份，依法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸小檗堿的平均含量為0.88%，RSD為 1.87%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液適量，分別于0，2，4，8，12，24h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為2.61%（n＝6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20190602，鹽酸小檗堿的含量為0.874%）6份，每份0.2 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入適量鹽酸小檗堿對(duì)照品，依法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)分別為20190601，20190602，20190701），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算喉蛾散中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3批樣品中鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇［5-6］

為盡可能多地采集到豐富的物質(zhì)成分信息，參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中黃連的鹽酸小檗堿、黃柏的鹽酸小檗堿，甘草的甘草苷、甘草酸，苦參的苦參堿、氧化苦參堿等指標(biāo)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)，曾分別于230，265，340nm波長(zhǎng)處進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果甘草苷、甘草酸峰高較低，分離度差，基線噪音影響大，定量不準(zhǔn)確。鹽酸小檗堿峰高相對(duì)較高，樣品干擾少，分離度好，且基線平穩(wěn)，適合作為含量測(cè)定指標(biāo)成分，故選擇鹽酸小檗堿最大吸收波長(zhǎng)265 nm作為喉蛾散中鹽酸小檗堿含量測(cè)定的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相選擇［7-10］

曾選擇乙腈-1.5%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、甲醇-水等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，采用乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，供試品溶液中鹽酸小檗堿與其他峰分離較好，故選其作為流動(dòng)相。

3.3 提取溶劑選擇［11-12］

在原供試品溶液制備方法基礎(chǔ)上考察了不同提取溶劑（70%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水）對(duì)含量測(cè)定指標(biāo)成分的影響，以水為溶劑進(jìn)行提取時(shí)，鹽酸小檗堿的含量明顯降低，70%甲醇和70%乙醇的差異不大，因甲醇具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，故選用乙醇體系的溶劑。分別對(duì)不同比例的乙醇提取溶劑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)70%乙醇為提取溶劑時(shí)得到的鹽酸小檗堿的含量最高，故最終選擇70%乙醇為提取溶劑。