一測(cè)多評(píng)法測(cè)定參芪扶正注射液中苯丙素苷類和核苷類成分含量

何昌雄

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350000）

參芪扶正注射液是由黨參和黃芪組方，2味中藥材經(jīng)水提取后與注射用氯化鈉配制而成，具有益氣扶正功效，用于肺脾氣虛引起的神疲乏力、少氣懶言、自汗眩暈，肺癌、胃癌見上述證候者的輔助治療［1］。其含有苯丙素苷類、核苷類、皂苷類、糖類等活性成分，苯丙素苷類和核苷類成分有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，在抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞等方面有較好的藥理作用［2-4］。參考文獻(xiàn)［5-7］，考慮到多指標(biāo)質(zhì)量控制需要的對(duì)照品種類和量較大，本研究中以參芪扶正注射液中的黨參苷Ⅰ和鳥苷為內(nèi)標(biāo)物，分別建立2種成分與黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、尿苷、腺苷間的相對(duì)校正因子，采用一測(cè)多評(píng)法（QAMS）同時(shí)測(cè)定參芪扶正注射液中8種成分的含量。QAMS法是在多指標(biāo)質(zhì)量控制時(shí)，以藥材中易得、價(jià)廉、穩(wěn)定的對(duì)照品的典型有效成分為內(nèi)標(biāo)物，建立該有效成分與其他成分間的相對(duì)校正因子，再通過校正因子計(jì)算出其他成分的含量。在方法實(shí)施時(shí)，可在只有1個(gè)對(duì)照品而其余對(duì)照品不足的情況下，可實(shí)現(xiàn)多種組分的同步含量測(cè)定，彌補(bǔ)了中藥制劑含量測(cè)定過程中需要對(duì)照品品種多且不易獲得的缺陷，已廣泛應(yīng)用于多種藥物活性成分的定量測(cè)定［8-9］。本研究中考察了所建立的相對(duì)校正因子在不同儀器及不同試驗(yàn)條件下的重現(xiàn)性；采用相對(duì)保留時(shí)間定位法對(duì)各待測(cè)成分色譜峰進(jìn)行定位；用t檢驗(yàn)比較QAMS法和高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)（ESM）法測(cè)定的結(jié)果，對(duì)將QAMS應(yīng)用于參芪扶正注射液多組分的含量測(cè)定進(jìn)行了較全面的考察?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters 2695型高效液相色譜儀，包括2695 Alliance四元梯度泵、2695 Alliance自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower 3色譜工作站、2998二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；1260 Infinity型高效液相色譜儀，包括G1311C四元梯度泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent EZchrom色譜工作站、G4212B二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；AUW-220D型電子天平（日本島津公司，精度為0.01 mg）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)（美國(guó)默克密理博公司）。

色譜柱：ShimadzuVP-ODSC18液相色譜柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；Waters Sunfire ODS C18液相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；Agilent Zorbax-C18液相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；Hypersil ODS C18液相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。

試藥：參芪扶正注射液（麗珠集團(tuán)利民制藥廠，批號(hào)分別為 1802115 ／1，1803222 ／2，1804105 ／1，1805261 ／2，1806162 ／1，1809052 ／2，規(guī)格為每瓶 250 mL）；黨參苷Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)為6257-45，含量為98%），黨參苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)為6257-73，含量為96.8%），黨參苷Ⅳ對(duì)照品（批號(hào)為 6257-82，含量為 97.6% ），丁香苷對(duì)照品（批號(hào)為 5124-11，含量為98.2%），胞苷對(duì)照品（批號(hào)為MUST-20151212，含量為 98.5%），均購自四川省成都曼思特公司；尿苷對(duì)照品（批號(hào)為110887-201803，含量為 99.5%，4℃冷藏保存），腺苷對(duì)照品（批號(hào)為110879-201703，含量為 99.7% ，4 ℃冷藏保存），鳥苷對(duì)照品（批號(hào)為 111977-201501，含量為 93.6%），均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)Merk公司，批號(hào)分別為1910318，191117）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷 0.2156，0.1707，0.155 8，0.100 3 mg 的對(duì)照品混合溶液，即得苯丙素苷類成分混合對(duì)照品溶液。取胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加純凈水制成每1 mL含胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷 0.090 4，0.148 6，0.118 4，0.120 3 mg的對(duì)照品混合溶液，即得核苷類成分混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密量取樣品50 mL，置200 mL棕色容量瓶中，加甲醇約120 mL，密塞，置冰箱（2～10℃）中浸漬過夜。精密量取樣品參芪扶正注射液25 mL，加在活化過的大孔樹脂上，用30%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得苯丙素苷類成分供試品溶液。避光操作。精密量取樣品50 mL，置200 mL容量瓶中，加純凈水約120 mL，密塞，超聲處理（功率為500 W，頻率為 40 kHz）40 min，放冷，加純凈水定容，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得核苷類成分供試品溶液。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件［10-13］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

苯丙素苷類成分：色譜柱為Agilent Zorbax-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈 -0.3% 甲酸溶液（39 ∶61，V／V）；流速為 1.0 mL ／min；UV 檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm；柱溫為35℃。

核苷類成分：色譜柱為Agilent Zorbax-C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇 -水（65 ∶35，V／V）；流速為 1.0 mL／min；UV檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；柱溫為35℃。

取混合對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.2 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取苯丙素苷類及核苷類成分混合對(duì)照品溶液 0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇及純凈水逐步稀釋，定容，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得各組分回歸方程及線性范圍。結(jié)果表明，各成分在各自線性范圍內(nèi)與峰面

積線性關(guān)系良好。取峰面積的信噪比（S／N）為10倍時(shí)的對(duì)照品質(zhì)量濃度為定量限（LOQ）。結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系和定量限考察結(jié)果（n＝6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取苯丙素苷類和核苷類成分混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰峰面積。結(jié)果黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷峰面積的RSD分 別 為 0.91% ，0.65% ，0.73% ，0.82% 和1.01%，0.54%，0.91% ，0.72% （n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為1806162／1），依法制備供試品溶液，分別于 0，3，6，9，12，20，24 h 時(shí)進(jìn)樣 10 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰峰面積。結(jié)果黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷峰面積的RSD分別為 1.03%，1.22%，1.13%，0.94%和 0.85%，0.91%，1.12%，1.04%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為1806162／1），依法平行制備6份供試品溶液，每份精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.96% ，0.73% ，0.62% ，0.51% 和 0.75% ，0.64% ，0.93%，0.87%（n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為1806162／1）6份，每份 25 mL，分別精密加入黨參苷Ⅰ（0.215 6 mg／mL）、黨參苷Ⅱ（0.170 7 mg／mL）、黨參苷Ⅳ（0.155 8 mg／mL）、丁香苷（0.100 3 mg ／mL）混合對(duì)照品溶液各 2.0，2.5，3.0 mL，依法制備苯丙素苷類成分供試品溶液，精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為 1806162／1）6 份，每份 25 mL，分別精密加入胞苷 （0.215 6 mg／mL）、鳥 苷 （0.215 6 mg／mL）、尿 苷（0.215 6 mg ／mL）、腺苷（0.215 6 mg ／mL）混合對(duì)照品溶液各 1.5，2.0，2.5 mL，依法制備核苷類成分供試品溶液，精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表2 4種苯丙素苷類成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.3 校正因子重現(xiàn)性考察及各組分色譜峰定位

校正因子的計(jì)算：以黨參苷Ⅰ和鳥苷為內(nèi)標(biāo)物，在2個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷和胞苷、尿苷、腺苷的校正因子按公式 ［fk／w＝fk／fw＝（Wk×Am）／（Wm×Ak）］計(jì)算，式中Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物濃度；Am為其他組分峰面積，Wm為其他組分濃度）進(jìn)行復(fù)核計(jì)算。結(jié)果表明，2個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的差異不明顯（RSD＜0.50%）。詳見表 4。

不同儀器及色譜柱的影響：考察了不同儀器和不同色譜柱對(duì)相對(duì)校對(duì)因子的影響，結(jié)果表明，所得相對(duì)校正因子差異不明顯（RSD＜0.60%）。詳見表5。

不同柱溫的影響：在不同的實(shí)驗(yàn)室，采用Waters 2695型高效液相色譜系統(tǒng)、Agilent Zorbax-C18色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，分別考察不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果表明，柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響不顯著（RSD＜0.50%）。詳見表6。

不同流速的影響：在同一實(shí)驗(yàn)室，采用Waters 2695型高效液相色譜系統(tǒng)、Agilent Zorbax-C18色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，分別考察不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果表明，流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響不顯著（RSD＜0.50%）。詳見表7。

表3 4種核苷類成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

待測(cè)組分色譜峰定位：查閱文獻(xiàn)［14-15］，相對(duì)保留時(shí)間定位法優(yōu)于保留時(shí)間差定位法，本試驗(yàn)中分別考察了采用不同色譜儀及色譜柱時(shí)，黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷色譜峰與黨參苷Ⅰ色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及胞苷、尿苷、腺苷色譜峰與鳥苷色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，不同色譜儀及色譜柱所測(cè)得的各組分相對(duì)保留時(shí)間無顯著差異（RSD＜0.50%）。詳見表8。

表4 苯丙素苷類與核苷類成分在不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的相對(duì)校正因子

2.4 QAMS法與ESM法測(cè)定結(jié)果的比較

采用QAMS法和ESM法測(cè)定6批樣品（批號(hào)分別為1802115／1，1803222／2，1804105／1，1805261／2，1806162／1，1809052／2）含量。依法制備苯丙素苷類和核苷類成分供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別采用ESM法和QAMS法計(jì)算參芪扶正注射液中各成分的含量，并對(duì)測(cè)定結(jié)果行t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，2種方法無顯著差異，詳見表9。

表5 不同儀器及色譜柱相對(duì)校正因子耐用性考察結(jié)果

表6 不同柱溫相對(duì)校正因子耐用性考察結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件選擇

檢測(cè)波長(zhǎng)確定：本試驗(yàn)中在190～400 nm波長(zhǎng)段分別掃描8種活性成分對(duì)照品溶液，結(jié)果黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷4種苯丙素苷類成分的最大吸收波長(zhǎng)為268 nm，胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷4種核苷類成分的最大吸收波長(zhǎng)為260 nm，為保證各成分都具有適宜的靈敏度和精密度，試驗(yàn)中采用2套光譜檢測(cè)波長(zhǎng)，保證均在最佳吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)8種成分。

流動(dòng)相選擇：根據(jù)待測(cè)組分理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的差異，本試驗(yàn)中分別采用2組流動(dòng)相進(jìn)行分離。由于核苷類成分（胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷）極性大，易溶于水，故采用甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等度洗脫，各色譜峰均可被檢出，與相鄰色譜峰分離效果較好，考慮乙腈較甲醇毒性大，易污染環(huán)境，且價(jià)格高，故選擇甲醇-水溶液等度洗脫作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相檢測(cè)核苷類成分。為使黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷4種苯丙素苷類成分得到良好分離，采用乙腈-0.3%甲酸溶液（39∶61，V／V）等度洗脫，優(yōu)化洗脫條件，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)出4種活性成分，該色譜條件下系統(tǒng)適用性均符合要求。

表7 不同流速相對(duì)校正因子耐用性考察結(jié)果

表8 不同色譜儀及色譜柱相對(duì)保留時(shí)間比較

3.2 QAMS法內(nèi)標(biāo)物選擇

黨參苷Ⅰ和鳥苷在參芪扶正注射液中含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定，便宜，易得，是實(shí)驗(yàn)室常用對(duì)照品，符合QAMS法對(duì)參照物的要求，故分別以黨參苷Ⅰ和鳥苷作為內(nèi)標(biāo)物，經(jīng)上述方法學(xué)考察，方法切實(shí)可行。

3.3 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性

考察了不同儀器、色譜柱、柱溫及流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果表明，各校正因子在以上不同條件下重現(xiàn)性均良好，QAMS法用于分析樣品中各成分的通用性較好，可在不同實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行含量檢測(cè)。

3.4 QAMS法色譜峰定位

中藥成分復(fù)雜，在不同色譜系統(tǒng)中會(huì)出現(xiàn)不同的色譜峰，在同一色譜系統(tǒng)中，其色譜峰的出峰時(shí)間、數(shù)量等也會(huì)受到色譜柱、柱溫等諸多因素的影響，因此待測(cè)成分色譜峰的定位至關(guān)重要。本試驗(yàn)中考察相對(duì)保留時(shí)間參數(shù)在不同品牌HPLC儀和不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，相對(duì)保留時(shí)間在不同色譜系統(tǒng)及色譜柱條件下波動(dòng)相對(duì)較小，且重現(xiàn)性較好（RSD＜0.50%）。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了測(cè)定參芪扶正注射液中苯丙素苷類成分（黨參苷Ⅰ、黨參苷Ⅱ、黨參苷Ⅳ、丁香苷）和核苷類成分（胞苷、鳥苷、尿苷、腺苷）的有效成分含量的QAMS法，該方法結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便有效、重現(xiàn)性高，可用于參芪扶正注射液中有效成分的含量測(cè)定。

表9 外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法測(cè)定8種有效成分含量結(jié)果（n＝6，μg／mL）