高效液相色譜法同時測定肝達(dá)康顆粒中5種成分含量

畢秋左，錢 洲

（云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000）

肝達(dá)康顆粒具有疏肝理脾、化瘀通絡(luò)功效，用于治療肝郁脾虛兼血瘀所致的肋痛腹脹、肋下痞塊，疲乏納差，大便溏薄，慢性乙型肝炎見上述證候者［1］。該制劑由柴胡（醋炙）、白芍（醋炙）、當(dāng)歸（酒炙）、枳實（麩炒）、青皮（麩炒）、茜草等組方。方中白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽［2］，芍藥苷為主要有效成分之一；枳實有行氣寬中、消食、化痰功能［3］；青皮舒肝破氣，消積化滯作用。枳實和青皮均屬蕓香科柑橘屬，物質(zhì)基礎(chǔ)基本相同［4］，均含有橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、新橙皮苷。該制劑收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)，但該標(biāo)準(zhǔn)僅對芍藥苷進(jìn)行了含量測定［5］。為更全面地評價肝達(dá)康顆粒的質(zhì)量，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時對其中芍藥苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷5種主要成分的含量進(jìn)行了測定?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀，包括G1311A型四元泵、G1329A ALS型自動進(jìn)樣器、G1316A TCC型柱溫箱和G1315D型可變波長紫外吸收檢測器（美國Agilent公司）；MS205DU型電子天平（梅特勒-托利多貿(mào)易＜上海＞有限公司，精度為十萬分之一）；WF-500EHT型超聲波清洗機(jī)（寧波海曙五方超聲波設(shè)備有限公司，功率為250 W，頻率為45 kHz）。

圖1 高效液相色譜圖

1.2 試藥

肝達(dá)康顆粒（國藥集團(tuán)德眾＜佛山＞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字 Z10980159，批號分別為 18010，18015，19001，規(guī)格為每袋4 g）；乙腈（色譜純，德國默克股份有限公司，批號為75-05-8）；甲醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司，批號為20181101）；水為娃哈哈純凈水；芍藥苷對照品（批號為110736-201741，含量為95.7% ），橙皮苷對照品（批號為 110721-201818，含量為 96.2%），柚皮苷對照品（批號為 110722-201714，含量為 93.4%），新橙皮苷對照品（批號為 111857-20103，含量為99.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷對照品（批號為101880，含量大于98%，江蘇永建醫(yī)藥科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：依利特 Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（B）-水（A），梯度洗脫（0～30 min時 8%B，30～36 min時 8%B～13%B，36～60 min時 13%B～19%B，60～85 min時 19%B～33%B，85～90 min時 33%B～80%B，90～95 min時 80%B，95～100 min時 80%B～8%B，100～105 min時 8%B）；檢測波長：237 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品適量，研細(xì)，取2.0 g，精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定，超聲提取30 min，取出，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液：取芍藥苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解成每 1 mL 分別含 0.388 2，0.234 8，0.115 6，0.359 0，0.137 3 mg 的混合貯備溶液。再精密吸取上述貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋成每 1 mL 分別含 0.077 64，0.047 68，0.023 12，0.071 80，0.027 46 mg 的混合對照品溶液。

陰性對照品溶液：按肝達(dá)康顆粒處方工藝，制備不含白芍（醋炙）、枳實（麩炒）和青皮（麩炒）的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1?？梢?，陰性對照無干擾，該方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項下對照品貯備溶液0.1，0.5，1.0，2.0，4.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，用 70%甲醇溶液定容，制成濃度梯度對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 5種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定。結(jié)果芍藥苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.41%，0.59%，0.65%，0.38% ，0.62% （n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為18010）樣品，約2.0g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果樣品中芍藥苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.20% ，0.33% ，0.48% ，0.31% ，0.56% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為18010）樣品，依法制備供試品溶液，于配制后 0，4，8，12，16，24 h 時按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.49% ，0.56% ，0.70% ，0.44% ，0.65% （n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為18010）適量，研細(xì)，取6份，每份約1 g，精密稱定，置150 mL錐形瓶，精密加入2.2項下對照品貯備液4 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計算含量。結(jié)果樣品中芍藥苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含量分別為1.6935，0.8837，0.4297，1.8869，0.5083mg／g，詳見表 3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg／g）

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

曾比較了甲醇、70%甲醇、50%甲醇3種溶劑對樣品提取效果的影響，結(jié)果顯示，3種溶劑對各目標(biāo)物的提取效率無明顯差異。對比色譜圖發(fā)現(xiàn)，以50%甲醇作為提取溶劑時目標(biāo)峰附近雜質(zhì)較多，參考文獻(xiàn)［6］，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方法及時間選擇

曾考察了超聲提取和加熱回流提取，加熱回流提取所得樣品溶液冷卻后不易濾過，超聲提取效果良好，且簡便易行；再對提取時間 0.2，0.5，1.0 h 的提取效率進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)0.5 h和1.0 h提取效率無明顯差異，參考文獻(xiàn)［7］，故選擇超聲提取 0.5 h。

3.3 流動相選擇

預(yù)試驗中，比較了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.4%磷酸及乙腈-水，發(fā)現(xiàn)以乙腈-水系統(tǒng)作為流動相時，各成分峰型良好，基線平穩(wěn)，分離效果符合要求，且配制簡單方便，故流動相選擇乙腈-水。

3.4 檢測波長選擇

采用二極管陣列檢測器對樣品進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)各待測組分于237 nm波長處響應(yīng)均良好，故選擇檢測波長為237 nm。