豬肺炎支原體中空纖維膜濃縮純化工藝研究

車巧林 董彥鵬 耿曉眉 郁偉軍 徐 鳳

（江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司，江蘇江陰 214400）

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhyo）是引起豬支原體肺炎的主要病原。豬支原體肺炎除引起豬的生長(zhǎng)受阻和飼料轉(zhuǎn)化率降低外，重要的是它能破壞豬呼吸道黏膜纖毛屏障，從而引起多種病原的繼發(fā)感染和混合感染，引起豬呼吸道疾病綜合征，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

疫苗在疾病預(yù)防中的地位日益重要，因此對(duì)疫苗質(zhì)量的要求也日益提高。在傳統(tǒng)和新型疫苗的制備中，應(yīng)用先進(jìn)的分離純化技術(shù)是提高疫苗效力、降低副反應(yīng)的有效手段。疫苗純化過(guò)程中常使用的方法有連續(xù)離心、沉淀、過(guò)濾、萃取、超速離心、微濾、超濾、層析等。傳統(tǒng)的離心、過(guò)濾、萃取和沉淀技術(shù)目前更多的是作為整個(gè)疫苗分離純化工藝的起始步驟，用于初步提純；而后期的超速離心、微濾、超濾、層析技術(shù)等方法則進(jìn)一步提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，使其達(dá)到疫苗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

中空纖維超濾是超濾技術(shù)中最為成熟與先進(jìn)的一種技術(shù)，它采用切向流過(guò)濾，即液體流動(dòng)方向與過(guò)濾方向垂直。與傳統(tǒng)的液體死端過(guò)濾相比，切向流過(guò)濾具有濾速快、效率高、不易堵塞的優(yōu)點(diǎn)，而且可根據(jù)需要控制濃縮和洗濾倍數(shù)，因此，在生物制品的生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。豬肺炎支原體大小200 nm左右，不適合采用超速離心和層析技術(shù)分離，因此選擇超濾技術(shù)對(duì)其進(jìn)行濃縮純化。本研究初步建立了豬肺炎支原體中空纖維濃縮純化工藝，并對(duì)豬肺炎支原體滅活菌液進(jìn)行濃縮純化，獲得了較好的效果。

1 材料

1.1 菌株

豬肺炎支原體HN0613株（代次F6），由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司鑒定并保存。

1.2 主要試劑及儀器

Friis基礎(chǔ)液及Friis培養(yǎng)基由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司自制；2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA）購(gòu)自 Sigma Aldrich 公司；無(wú)水硫代硫酸鈉購(gòu)自Alfa Aesar公司。

300 kD、500 kD、750 kD中空纖維超濾柱、0.1 μm中空纖維微濾柱購(gòu)自GE公司。豬肺炎支原體微量間接血凝（IHA）檢測(cè)試劑盒由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司自制；50 L發(fā)酵罐購(gòu)自上海百侖生物科技有限公司，超濾系統(tǒng)購(gòu)自利穗科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

1～1.5kg日本大耳白兔，豬肺炎支原體IHA抗體陰性（效價(jià)＜1：5），購(gòu)自蘇州湖橋生物科技有限公司。

2 方法

2.1 豬肺炎支原體菌液的制備

豬肺炎支原體HN0613株凍干菌種用Friis培養(yǎng)基溶解，以10%比例接種于Friis培養(yǎng)基，37 ℃ 靜置培養(yǎng)，pH 6.7～6.8時(shí)收獲。收獲菌液以5%比例傳代兩次后再以4～5%的比例接種發(fā)酵罐，通氣量設(shè)置為0.8 Nm3/h，罐壓維持0.06 MPa，37℃培養(yǎng)2～4d，待pH下降至6.7～6.8時(shí)收獲，收獲菌液進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)及CCU測(cè)定。

2.2 中空纖維膜孔徑大小的選擇

使用300 kD、500 kD、750 kD和0.1 μm的中空纖維膜分別對(duì)豬肺炎支原體活菌液進(jìn)行濃縮純化，剪切速率控制在3 000 s-1，跨膜壓TMP控制在0～10 psi，將抗原濃縮5倍后用無(wú)菌PBS進(jìn)行動(dòng)態(tài)平衡洗濾。每次洗濾液取1mL用于總蛋白含量測(cè)定。

2.3 純化過(guò)程中洗濾液的選擇

使用750 kD的中空纖維膜對(duì)豬肺炎支原體活菌液進(jìn)行濃縮純化，剪切速率控制在3 000s-1，跨膜壓TMP控制在0～10 psi。第一次純化，抗原濃縮5倍后用無(wú)菌PBS動(dòng)態(tài)洗濾5次；第二次純化，抗原濃縮5倍后用無(wú)菌不含豬血清的Friis基礎(chǔ)液（以下簡(jiǎn)稱Friis基礎(chǔ)液）動(dòng)態(tài)洗濾5次。濃縮、純化過(guò)程中的透過(guò)液和洗濾液均取1 mL用于CCU測(cè)定。

2.4 純化過(guò)程中剪切速率的選擇

使用750 kD中空纖維膜對(duì)豬肺炎支原體活菌液進(jìn)行濃縮純化，剪切速率分別控制在1000 s-1、2 000 s-1、4 000 s-1、6 000 s-1和8 000 s-1，跨膜壓TMP控制在0～10 psi，抗原濃縮5倍后用Friis基礎(chǔ)液動(dòng)態(tài)洗濾5次，收集過(guò)程中計(jì)算通量，并對(duì)最后收獲的截留液進(jìn)行CCU測(cè)定。

2.5 豬肺炎支原體滅活菌液的濃縮純化

豬肺炎支原體活菌液經(jīng)終濃度0.4 mM BEI滅活，10 mmol/L硫代硫酸鈉終止后，取少量進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后用于純化。

使用0.1μm中空纖維膜對(duì)豬肺炎支原體滅活菌液進(jìn)行濃縮純化，剪切速率控制在4 000 s-1，跨膜壓TMP控制在0～10 psi，將抗原濃縮5倍后用Friis基礎(chǔ)液洗濾7次，每次洗濾取30ml洗濾液。通過(guò)SDS-PAGE分析豬肺炎支原體滅活抗原純化前及濃縮純化過(guò)程洗濾液蛋白圖譜，BCA法測(cè)定純化前及濃縮純化過(guò)程中總蛋白含量。

2.6 豬肺炎支原體滅活菌液純化前后免疫原性測(cè)定

豬肺炎支原體純化洗濾3次、5次和7次的收集液先分別稀釋5倍恢復(fù)至原液，然后連同豬肺炎支原體純化前滅活菌液與Gel佐劑分別乳化配苗，免疫1～1.5kg豬肺炎支原體IHA抗體陰性的健康日本大耳白兔，每組免疫5只，每只后腿肌肉注射疫苗0.5 ml。免疫后14d，以相同劑量和途徑進(jìn)行二免，剩余5只不免疫作為陰性對(duì)照。二免后28d，所有兔子采血、分離血清，IHA檢測(cè)兔血清中豬肺炎支原體抗體效價(jià)，評(píng)判純化過(guò)程中經(jīng)不同次數(shù)洗濾豬肺炎支原體免疫原性是否受到影響。

3 結(jié)果

3.1 豬肺炎支原體菌液的制備

50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的豬肺炎支原體菌液無(wú)菌檢驗(yàn)合格，CCU測(cè)定結(jié)果為109CCU/ml。

3.2 中空纖維膜孔徑大小的選擇

通過(guò)BCA法測(cè)定純化前及各個(gè)孔徑中空纖維膜濃縮純化過(guò)程中收集液的總蛋白含量，以此計(jì)算雜蛋白去除率，結(jié)果見(jiàn)表1。豬肺炎支原體活菌液經(jīng)300 kD、500 kD、750 kD和0.1μm中空纖維膜濃縮5倍、洗濾5次后雜蛋白去除率分別為63.57%、70.79%、81.27%和86.10%，由此看出750 kD和0.1 μm中空纖維膜純化效果較好，蛋白去除率達(dá)80%以上。

3.3 純化過(guò)程中洗濾液的選擇

通過(guò)對(duì)比無(wú)菌PBS和Friis基礎(chǔ)液兩種洗濾液濃縮、純化過(guò)程中透過(guò)液、收集液的CCU，評(píng)判濃縮純化過(guò)程中豬肺炎支原體的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。從表中可以看出豬肺炎支原體活菌液經(jīng)750 kD中空纖維膜濃縮5倍后CCU是濃縮前的5倍，且濃縮及純化過(guò)程中透過(guò)端沒(méi)有檢測(cè)到CCU，但是用PBS洗濾時(shí)隨著洗濾次數(shù)的增加豬肺炎支原體的CCU在降低，洗濾5次后CCU僅為105，而用Friis基礎(chǔ)液洗濾5次豬肺炎支原體CCU仍為濃縮前的5倍，5×109，這說(shuō)明純化時(shí)用Friis基礎(chǔ)液洗濾，活菌液回收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PBS洗濾時(shí)的活菌液回收率。

表1 Mhyo菌液經(jīng)不同孔徑中空纖維膜濃縮純化過(guò)程中總蛋白含量及雜蛋白去除率

表2 純化過(guò)程中不同洗濾液洗濾對(duì)Mhyo活菌液CCU和抗原回收率的影響

3.4 純化過(guò)程中剪切速率的選擇

使用750 kD的中空纖維膜對(duì)豬肺炎支原體活菌液進(jìn)行濃縮純化，不同剪切速率下的通量及截留液豬肺炎支原體CCU見(jiàn)表3，從中可以看出剪切速率在2 000 s-1以上時(shí)，通量可以達(dá)到20 L/h以上，適合生產(chǎn)中抗原的大量處理，但是當(dāng)剪切速率達(dá)到8 000 s-1時(shí)，豬肺炎支原體活菌液CCU降到108，因此豬肺炎支原體純化過(guò)程中剪切速率應(yīng)控制在2 000～6 000s-1。

表3 不同剪切速率下的通量及Mhyo活菌液CCU

3.5 豬肺炎支原體滅活菌液的濃縮純化

使用 0.1 μm中空纖維膜對(duì)豬肺炎支原體滅活菌液進(jìn)行5倍濃縮，并用Friis基礎(chǔ)液洗濾7次，收集濃縮液及洗濾液，通過(guò)SDS-PAGE分析豬肺炎支原體滅活菌液純化前及濃縮純化過(guò)程中蛋白圖譜，BCA法測(cè)定純化前及濃縮純化過(guò)程中總蛋白含量，以此判斷和計(jì)算雜蛋白去除率，結(jié)果見(jiàn)圖1和表4。從圖1可以看出洗濾4次后雜蛋白明顯減少，從表4可以看出豬肺炎支原體滅活菌液經(jīng)0.1 μm中空纖維膜濃縮5倍、洗濾7次后雜蛋白去除率可以達(dá)到94.66%。

圖1 Mhyo滅活菌液純化前及純化過(guò)程中洗濾液SDS-PAGE；

表4 Mhyo滅活菌液濃縮純化（0.1 μm）過(guò)程中總蛋白含量及雜蛋白去除率（BCA法）

3.6 豬肺炎支原體滅活菌液純化前后免疫原性測(cè)定

豬肺炎支原體純化洗濾3次、5次和7次的收集液，豬肺炎支原體純化前滅活菌液與Gel佐劑分別乳化配苗，免疫1～1.5 kg豬肺炎支原體IHA抗體陰性的健康日本大耳白兔，二免后28天采血分離的兔血清用IHA測(cè)定豬肺炎支原體抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表5，從表中可以看出，豬肺炎支原體滅活菌液濃縮5倍洗濾7次，豬肺炎支原體平均效價(jià)與濃縮前相比沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明豬肺炎支原體經(jīng)0.1 μm的中空纖維膜濃縮純化仍能保持良好的免疫原性。

表5 Mhyo滅活菌液純化前及純化過(guò)程中免疫原性（抗體效價(jià)）變化

4 討論

隨著社會(huì)科技的日新月異，膜在生活科技領(lǐng)域的應(yīng)用不斷擴(kuò)大并發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在膜分離領(lǐng)域中，超濾、微濾是兩種應(yīng)用最為廣泛的膜過(guò)程，主要用于化工分離與精制、廢水處理、膜生物反應(yīng)器等。中空纖維膜具有比表面積大、產(chǎn)量高、便于加工制作、造價(jià)低、易于維護(hù)管理等優(yōu)點(diǎn)，因此得到了廣泛的應(yīng)用和研究?，F(xiàn)階段，中空纖維超濾膜廣泛應(yīng)用于酶提純與分級(jí)、中藥制劑的制備、抗生素的濃縮與精制、疫苗的濃縮與純化、菌體的去除，地表水、飲用水、廢水處理等分離過(guò)程。

超濾技術(shù)在疫苗純化領(lǐng)域首先應(yīng)用在重組乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg上，早在1989年，Youn和Samanta用超濾膜對(duì)HBsAg哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行10倍濃縮，隨后通過(guò)聚乙二醇沉淀、凝膠過(guò)濾柱層析、KBr密度超離心和蔗糖密度梯度超離心獲得純度大于98%的HBsAg。1992年，Chai等應(yīng)用截流量100kD的中空纖維超濾膜對(duì)含有HBsAg的酶解液進(jìn)行了濃縮純化，回收率高達(dá)97.7%，用該方法獲得的抗原制備的B型乙肝疫苗用于兒童疫苗接種，抗體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為100%，且重組疫苗質(zhì)量高于從乙肝病毒攜帶者血液中提取乙肝表面抗原制成的疫苗。2012年，胡業(yè)勤等采用中空纖維超濾法純化脫毒后的無(wú)細(xì)胞百日咳抗原，并與透析法進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示超濾法去除無(wú)細(xì)胞百日咳抗原溶液中脫毒劑和色素的效率更高，3 h內(nèi)即可完成，且所得原液的回收率為92.1%，接近透析法的回收率，原液效價(jià)為11.166 IU/ml，高于透析法獲得的原液效價(jià)9.211 IU/ ml。本研究對(duì)豬肺炎支原體菌液進(jìn)行了中空纖維超濾膜濃縮純化工藝摸索，確定了超濾膜孔徑大小、洗濾液及剪切速率，并對(duì)滅活菌液進(jìn)行濃縮純化，測(cè)定了雜蛋白去除率，以及濃縮前后豬肺炎支原體免疫原性的變化，結(jié)果表明應(yīng)用中空纖維膜對(duì)豬肺炎支原體進(jìn)行濃縮純化可以獲得滿意的效果，考慮到大規(guī)模生產(chǎn)中抗原處理量大，建議疫苗生產(chǎn)中使用0.1 μm微濾膜。