基于EMS誘變的晉麥90號小麥抗寒突變體創(chuàng)制

武銀玉，范紹強，孫黛珍，曹亞萍

（1.山西農業(yè)大學小麥研究所，山西臨汾041000；2.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801）

小麥是我國重要的糧食作物，小麥生產可持續(xù)發(fā)展對于保障國家糧食安全和維護社會穩(wěn)定都具有重要意義。近年來，在全球氣候變暖的背景下，冬小麥種植區(qū)域呈現不同程度的北移西擴，部分栽培品種趨于春性化[1]，育成品種也降低了對小麥抗寒性的考驗[2]，加之冬季持續(xù)高溫，致使小麥抗寒鍛煉不足，生育期提前，遇冬春凍融交替和春季低溫（倒春寒）等異常天氣，將對小麥生產構成潛在威脅，極端氣候成為小麥產量損失的主要災害[3]。

甲基磺酸乙酯（Ethyl Methane Sulfonate，EMS）是一種高效穩(wěn)定的烷化類誘變劑，能誘發(fā)產生高密度系列等位基因點突變，具有種質創(chuàng)新頻率高、遺傳變異譜寬、育種周期短等特性，可彌補小麥常規(guī)育種短時間難以獲得新性狀和新基因的不足，在創(chuàng)造作物新品種、新種質、遺傳材料以及解決育種工作中某些特殊問題等方面取得突破，育種中多應用于對作物的某一特殊性狀進行改良。目前，小麥EMS誘變技術已在國內外得到大規(guī)模研究和應用。HUSSAIN等[4]用EMS誘導中抗葉銹小麥品種NNGandum-1，得到9個高抗和2個高感突變體；李曉等[5]用EMS誘變京411，獲得Wx-A1基因的7個點突變，其中，有功能變異的4個突變系均可穩(wěn)定遺傳至下一代；ZHANG等[6]用EMS處理YZ4110，獲得晚抽穗期突變體m605，該突變體可使秋季播種時間至少延遲7 d。迄今尚未發(fā)現有采用EMS誘變技術誘導抗寒突變體的報道。

晉麥90號是山西農業(yè)大學（山西省農業(yè)科學院）小麥研究所采用遠緣種間漸進式復合雜交和穿梭育種相結合的方法選育而成的小麥品種，2011年通過山西省品種審定。該品種抗旱節(jié)水，根系發(fā)達，抗干熱風能力強，抗倒伏性好，成熟落黃好，生物產量和經濟產量都較高，是一個優(yōu)良的旱地小麥品種，品質符合國標中筋優(yōu)質麥標準，粗蛋白質15.21%，濕面筋35.0%，穩(wěn)定時間6.2 min。但是該品種尚存在缺陷，即抗凍耐寒性較差，常年抗寒性為2級，遇寒冷災害年份易對產量造成較大影響。

本研究以晉麥90號小麥品種為試驗材料，用EMS處理種子，在鑒選表型突變體的基礎上，對抗寒性進行了鑒定和分析，旨在選育抗寒突變體，為小麥抗寒育種和基因研究提供新的種質資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 種子誘變處理 晉麥90號由山西農業(yè)大學小麥研究所保存。參照曹亞萍等[7]提供的方法，挑選晉麥90號大小均勻、籽粒飽滿的種子1 kg，用蒸餾水室溫浸種10 h，使種子充分膨脹萌動后，放在吸水紙上晾干，18℃條件下用0.8%EMS誘變劑浸種10 h，裝入網袋，用自來水反復沖洗0.5 h，去除表面殘留的EMS誘變液，風干，2 d后播種。

1.1.2 誘變材料種植 M1不進行選擇，按單株收獲，脫粒后按收獲籽粒由多到少順序編號，作為突變體的原始編號，共計1 282份，編號為1～1 282；M2單行等粒點播，根據株高、株型、穗型、葉色、分蘗等選擇各種表型突變體，將突變體按株系分單株收獲；對M3突變體進行抗寒性鑒定。

1.2 試驗設計

M2分2個試點種植，試點1位于山西省臨汾市堯都區(qū)山西農業(yè)大學小麥研究所試驗田（N36°6′24″，E111°30′48″），屬黃淮中部麥區(qū)；試點 2 位于山西省晉中市太谷縣山西農業(yè)大學試驗田（N37°25′16″，E112°34′52″），屬黃淮北部麥區(qū)。2 個試點種植同一套材料，按原始編號順序排列，單行區(qū)，行長2 m，行距0.25 m，每行30粒，每30行插入1行對照野生型晉麥90號。試點1用于進行表型突變體鑒選，試點2參照試點1突變體鑒選結果，按編號收獲能正常越冬成熟的突變株系中的每個單株，各單株編號是在原始編號后加二級編號，如原始編號為302的株系共收獲7個單株，則每個單株編號分別為302-1、302-2、……、302-7。M3將試點 2 收獲籽粒較多的單株種植于試點1，采用二級編號，順序排列，3次重復，每單株種植單行區(qū)，行長2 m，行距0.25 m，每行40粒，每30行插入1行對照野生型晉麥90號。試驗田肥力均勻，播種深度一致，四周設有保護行。

1.3 抗寒性鑒定

依據返青期葉片和莖受凍害程度進行鑒定，按照趙瑞玲等[8]描述的鑒定方法，將凍害分為5級，即0級：葉片沒有凍死部分；1級：葉片凍死部分僅限于葉尖，下部葉片未受凍或很少，全田綠色葉較多；2級：葉片凍死部分少于綠葉部分，但下部葉凍死者較多，地面有枯黃葉；3級：葉片凍死部分多于綠葉部分，地面可見整片枯葉，綠色葉片較少；4級：上下部葉片全部凍死枯黃，全是枯葉，甚至全株死亡。記載時，每小區(qū)凍害等級依據80%單株表現而定，并增設“-”、“+”符號作補充，如“2-”表示比 2 級凍害輕些，“2+”表示比2級凍害重些。

1.4 統(tǒng)計分析

為方便計算，凍害等級 0、1-、1、1+、2-、2、2+、3-、3、3+ 分別賦予抗寒值為 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1。采用Microsoft Excel 2003整理數據并作圖，采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

越冬成活率＝收獲株數/幼苗株數×100%（1）

2 結果與分析

2.1 突變體抗寒性篩選

在試點1對M21 282份誘變材料進行農藝性狀鑒定，全生育期每3～5 d田間調查一次，觀察記載幼苗、葉片、莖、分蘗、穗部、育性等性狀，共篩選到126份表型突變體。試點2因平均氣溫較低、氣候條件嚴酷，與試點1對應的126個突變體中有114個有正常越冬植株，共收獲692株，越冬成活率僅為18.3%，明顯低于野生型品種晉麥90號的平均越冬成活率（52.3%），說明突變群體中抗寒性弱的突變體多于強突變體，EMS誘變對晉麥90號抗寒性具有負向效應。

2.2 突變體抗寒性鑒定

選擇M2收獲籽粒較多的突變體共計265份，在試點1對M3進行抗寒性鑒定，結果表明，晉麥90 號突變體凍害等級分布在 0、1-、1、1+、2-、2、2+、3-、3、3+，共 10 個等級，由于 M2在寒冷生態(tài)區(qū)進行了抗寒性篩選，無4級凍害突變體出現，其中，晉麥90號屬“2-”級。在所有突變體中，凍害級別分布主要集中在2-、2、2+、3-這4個等級，分別占調查株系總數的16.23%、19.62%、19.62%和16.98%；其次為 1、1+、3、3+ 等級，分別占調查株系總數的3.78%、8.68%、7.93%、5.28%；抗寒性強的突變體較少，0級和1-級分別占總數的0.75%和1.13%。

從M3突變體抗寒性分布來看，3個重復抗寒性趨勢一致（圖1）。在鑒定突變體抗寒性時，對凍害等級進行了更為詳細的劃分，每一等級鑒定出數量不等的突變體，表明晉麥90號突變體抗寒性分布由強到弱存在連續(xù)性，自交純合后將得到抗寒性由強到弱的系列表型變異，有利于進行小麥抗寒基因結構與功能研究，為推動抗寒性基礎研究儲備遺傳材料。

2.3 突變體抗寒性差異分析

對M3所有株系抗寒性按由強到弱排列并進行新復極差比較，在1%差異水平下，較晉麥90號抗寒性極顯著增強的有38個株系、極顯著減弱的有176個株系，無極顯著差異的有51個株系；在5%差異水平下，較晉麥90號抗寒性顯著增強的有38個株系、顯著減弱的有183個株系，無顯著差異的有44個株系。數據比較分析結果表明，265個突變體抗寒性由強到弱呈連續(xù)性分布，分別發(fā)生在114個誘變的原始單株上，推測可能存在不同的突變位點，可得到抗寒性由強到弱的系列表型變異和突變基因；以野生型品種晉麥90號為對照，抗寒性弱的突變體多于強突變體，加之M2冷脅迫選擇剔除了部分弱抗寒性突變體，再次證明EMS誘變對小麥抗寒性突變具有負向效應。

將5個抗寒性最強的突變體分析結果按順序列于表1，可以看出，這5個材料抗寒值最低為9，凍害等級為1-，田間調查發(fā)現，僅下部部分葉片葉尖受凍，表現為極強的抗寒性；這5個突變體抗寒性也具有極顯著差異，112-1抗寒性極顯著強于927-1、718-5、316-4這 3 個材料，542-3抗寒性極顯著強于316-4、718-5這2個材料。鑒定出的5個突變體分別來源于不同的原始單株，如突變位點存在差異，則將得到5個強抗寒性基因，成為小麥抗寒育種的優(yōu)異基因資源。

表1 強抗寒性突變體差異性比較

對原始編號相同且二級編號種植數目≥5的8個M3群體進行方差分析，結果表明（表2），不同群體的抗寒性在3個重復間均表現一致，沒有顯著差異，說明試驗田生態(tài)條件同質性較好，生育期間試驗田未出現局部寒流影響，同時也說明M3各株系內抗寒性趨于穩(wěn)定；而株系間方差除186群體外，其余均存在極顯著差異，說明突變體抗寒性在M3株系間仍表現較大分離。

對株系間存在極顯著差異的7個群體分別進行新復極差比較，結果表明（表3），各群體內株系間抗寒性差異表現為2種類型：3個群體株系間抗寒性呈間斷性分布，如295群體差異明顯分為3個等級，295-10 抗寒性最好，295-1 次之，295-7、295-8、295-9株系較差，404群體、506群體內株系間抗寒性差異同樣可明顯分為2個等級；4個群體株系間抗寒性呈連續(xù)性分布，如原始編號為326的群體，5個株系抗寒性不能進行明確分類，326-9與326-3、326-5、326-1 存 在 極 顯 著 差 異 ，326-3、326-5、326-1株系間無顯著或極顯著差異，但326-6僅與326-1存在極顯著差異，而與326-3、326-5間無極顯著差異，302、718、812群體也存在這種情況。另外，各群體內株系間抗寒值極差也存在較大差異，如718群體，株系間抗寒值極差為6，718-5株系抗寒性最強，凍害等級為1-，718-10、718-11抗寒性最弱，凍害等級均為3-，說明該群體內株系間抗寒性分離較大；而326群體抗寒值極差僅為1.33，說明該群體整體抗寒性趨于一致。

表2 突變體抗寒性方差分析

表3 突變體株系抗寒值間新復極差比較

3 結論與討論

低溫凍害是黃淮麥區(qū)頻發(fā)的自然災害之一，嚴重影響并制約著小麥的生長發(fā)育和產量形成[9-10]。提高小麥抗寒性的途徑可歸納為3個：一是外源誘導。WANG等[11]將水楊酸（SA）溶液噴灑在揚麥16小麥葉片上，誘導內源H2O2和ABA積累，可顯著提高品種的抗凍性；劉麗杰等[12]通過葉面噴施E-BR可促進小麥幼苗對可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的積累，從而增強小麥對低溫的抗性。二是抗寒基因。目前小麥21條染色體已發(fā)現有15條攜帶抗寒相關基因[13]，5A和5D染色體攜帶有抗寒主效基因[14-15]，研究較多的基因有Vrn、Fr等；Fr2（Frost resistancs 2）為抗霜凍基因，包括幾個串聯重復的CBF（C-repeat bindingfactor），誘導COR基因（cold-regulated gene）的表達，可顯著增強小麥對干旱和霜凍脅迫抗性[16-17]；游光霞等[18]研究表明，Vrn1基因是小麥抗寒性遺傳調控的關鍵位點，其會顯著降低品種的抗寒性，具有2個或3個Vrn1基因的品種一般抗寒性較弱，3個位點均為隱性基因的小麥品種具有較強抗寒性，建議黃淮海北部麥區(qū)加強選育、推廣vrn-A1、vrn-B1、vrn-D1基因型品種。三是抗寒育種。MICHEL等[19]研究表明，用抗寒性好的材料進行雜交，并用抗凍性QTLFr-A2進行標記輔助選擇，可培育耐寒性小麥品種；GRABOVETS等[20]分析了俄羅斯國家38個品種，發(fā)現有29個具備抗寒性并可承受-18℃低溫，表明選用遺傳差異較大的材料進行雜交，在霜凍頻繁地區(qū)采用系譜法選擇，可以獲得抗寒性強的小麥品種。迄今尚未發(fā)現運用誘變方法進行小麥抗寒種質創(chuàng)新進而提高小麥品種抗寒性的研究。本研究用EMS誘變劑處理晉麥90號小麥種子，M2選擇各種表型突變體，并在寒冷生態(tài)區(qū)進行抗寒性篩選；M3進行抗寒性鑒定，得到5個強抗寒性突變體，創(chuàng)新了小麥抗寒種質創(chuàng)制方法。

本研究在抗寒新種質鑒選時，M2選擇了2個試驗點，試點2位于晉中市太谷縣，該區(qū)平均氣溫較低，氣候條件嚴酷，秋冬季冷空氣活動頻繁，常年種植強冬性高抗寒品種，在該試點對M2進行冷脅迫強化選擇，可以剔除大批低溫敏感材料，減輕后代選擇壓力；M3在試點1臨汾市堯都區(qū)進行抗寒性鑒定，恰逢暖冬干旱年份，2019年12月平均氣溫為0.07℃，較2018年（2018年12月平均氣溫-1.85℃）高1.92℃，導致小麥冬季持續(xù)生長，抗寒鍛煉時期縮短，抗寒能力降低，2020年1月5—7日出現21.67 mm降水（雪），1月11日積雪消融，凍融交替后又遇到1月14日春寒，同期播種小麥普遍受凍，為突變體的抗寒性鑒定提供了良好的生態(tài)條件。

本研究通過EMS誘變和抗寒性篩選，創(chuàng)制出5個抗寒性好的突變體，即112-1、316-4、542-3、718-5、927-1，分別來源于不同的原始單株，方差分析結果表明，其抗寒性具有差異，推測這5個突變體可能突變位點不同，都將成為小麥抗寒育種的優(yōu)異種質資源；此外，本研究還鑒定出抗寒性由強到弱的系列突變體，有利于進行小麥抗寒基因結構與功能研究，為推動抗寒性基礎研究儲備了遺傳材料。