一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶-2在不同類型胃食管反流病中的表達(dá)及意義

岳愛君,尹宇杰,李瑩,天津市職業(yè)病防治院急診內(nèi)科 天津市 300011

0 引言

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)可分為非糜爛性胃食管反流病(non-erosive reflux disease,NERD)、反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)、Barrett食管(Barrett esophageal,BE)三種類型.有學(xué)者報(bào)道[1]GERD這三種類型轉(zhuǎn)化少,獨(dú)立性較強(qiáng),預(yù)后有一定差異.隨著臨床對(duì)GERD病理生理機(jī)制研究的深入,其診斷準(zhǔn)確性和治療有效性已得到較大改善,但由于GERD病因多樣,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,不同類型GERD病理學(xué)表現(xiàn)不盡相同,在GERD診治方面仍需進(jìn)一步加強(qiáng).在GERD的診斷方面,RE、BE可通過胃鏡、病理進(jìn)行可靠診斷,但NERD在胃鏡下并無(wú)食管損傷客觀依據(jù),主要靠臨床癥狀進(jìn)行辨別,難度較大.近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase,NOS)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)可能參與了GERD的發(fā)生發(fā)展[2,3].但關(guān)于NOS、COX-2在不同類型GERD中的表達(dá)報(bào)道較少,而關(guān)于NOS與COX-2關(guān)系的研究更是未見報(bào)道.基于此,本研究對(duì)不同類型GERD患者的NOS、COX-2的表達(dá)水平進(jìn)行分析,旨在分析NOS、COX-2關(guān)系,并為臨床不同類型GERD的診治提供參考,現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料:前瞻性選取2015-01/2019-12我院內(nèi)科收治的GERD患者78例作為觀察組,男43例,女35例,年齡26-72歲,平均年齡49.24歲±11.56歲.按照GERD不同類型分為NERD、RE、及BE 3組.

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn):納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)制定的《2014年中國(guó)胃食管反流病專家共識(shí)意見》[4]中關(guān)于GERD的診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)食管pH監(jiān)測(cè)和病理學(xué)檢查確診；(2)患者自愿參與研究,并簽署知情同意書；(3)無(wú)腹部手術(shù)史；(4)無(wú)幽門螺桿菌感染.

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn):排除標(biāo)準(zhǔn):(1)惡性腫瘤等嚴(yán)重器質(zhì)性病變者；(2)消化道出血或消化性潰瘍等其他消化性疾病者；(3)糖尿病等嚴(yán)重全身性代謝疾病者；(4)1 wk內(nèi)呼吸道感染史或肺部感染史者.另選取同期在本院門急診及體檢中心進(jìn)行胃鏡檢查的26例健康人群作為對(duì)照組.

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)鏡檢查:檢查前14 d停止抑制胃酸分泌及抑制NOS分泌等GERD治療藥物,檢查前12 h常規(guī)禁食禁水.對(duì)所有納入對(duì)象應(yīng)用電子內(nèi)鏡(日本Olympus公司,GIF-Q240型)進(jìn)行檢查,觀察并記錄胃內(nèi)組織病理表現(xiàn),并根據(jù)不同類型進(jìn)行分組.內(nèi)鏡下表現(xiàn)為RE、BE者,于病變部位進(jìn)行活檢,留取1-2塊活檢組織；內(nèi)鏡下表現(xiàn)為NERD者或正常對(duì)照組成員,則于食管遠(yuǎn)端鱗狀上皮與柱狀上皮交界處上方2 cm處取活檢組織1-2塊.將取得的標(biāo)本迅速置于-80℃的液氮中冷藏待檢.

節(jié)水增糧行動(dòng)項(xiàng)目規(guī)?；ㄔO(shè)高效節(jié)水灌溉工程，覆蓋范圍廣、資金投入大，涉及農(nóng)民切身利益，能否長(zhǎng)期運(yùn)行發(fā)揮效益關(guān)系經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定，因此項(xiàng)目建設(shè)過程必須要嚴(yán)格管控、建管并重，尤其是項(xiàng)目后期運(yùn)行維護(hù)要嚴(yán)抓不怠。項(xiàng)目實(shí)施過程要加強(qiáng)督查指導(dǎo)，完善管理措施，確保工程質(zhì)量；建成運(yùn)行后要進(jìn)一步完善工程運(yùn)行管護(hù)機(jī)制，落實(shí)運(yùn)行維護(hù)經(jīng)費(fèi)來(lái)源，配備專職人員對(duì)地下水水井、輸水管線、微灌設(shè)施和電氣化設(shè)備進(jìn)行定期保養(yǎng)、維護(hù)和更新，保障節(jié)水增糧行動(dòng)工程建設(shè)規(guī)范、使用便捷、管護(hù)得當(dāng)、長(zhǎng)期受益。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測(cè)NOS mRNA及COX-2 mRNA的表達(dá):(1)總RNA提取:取液氮速凍標(biāo)本,研磨裂解后,利用Trizol試劑盒提取總RNA,并采用紫外分光光度計(jì)(Alpha1型,上海譜元儀器有限公司)測(cè)定RNA純度,吸光度(A)比值A(chǔ)260/A280≥1.8提示RNA提取成功；(2)mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA:利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；(3)qRT-PCR擴(kuò)增:以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以GAPDH基因作為內(nèi)參照,NOS引物序列由上海生物工程技術(shù)公司合成,參照NCBI GenBank提供的人類基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì).COX-2、GAPDH引物序列見表1.PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性60 s,92℃變性30 s,56℃退火30 s,74℃延伸30 s,重復(fù)38個(gè)循環(huán).利用用 2-△△Ct法對(duì)組織中NOS mRNA及COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算,檢測(cè)中所采用的引物、Trizol試劑盒均有上海生物工程技術(shù)公司提供,其余試劑由北京奧科生物技術(shù)有限公司,試劑盒檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0處理數(shù)據(jù),計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用(mean±SD)表示,行單因素分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Person檢驗(yàn)；指標(biāo)的檢測(cè)價(jià)值采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線進(jìn)行分析.P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較 內(nèi)鏡及組織病理學(xué)檢查顯示,78例GERD患者中,RE組26例、NERD組28例、BE組24例；各組患者在性別年齡等一般資料比較無(wú)顯著差異(P＞0.05),具可比性(表2).

2.2 各組患者NOS mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)水平比較 3種不同類型GERD的NOS mRNA[神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS) mRNA、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA]、COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(圖1和2),且BE組NOS mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯高于RE組,RE組NOS mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯高于NERD組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).詳見表3.

2.3 NOS mRNA與COX-2 mRNA的相關(guān)性分析 nNOS mRNA、iNOS mRNA與COX-2 mRNA均呈顯著正相關(guān)(r=0.900、0.897,P＜0.05).見圖3和4.

2.4 nNOS mRNA、iNOS mRNA與COX-2 mRNA表達(dá)水平對(duì)NERD的診斷 ROC曲線分析顯示,nNOS mRNA診斷NERD的AUC為0.662,iNOS mRNA診斷NERD的AUC為0.671,COX-2 mRNA診斷NERD的AUC為0.613；Z檢驗(yàn)AUC發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),根據(jù)最佳臨界值,當(dāng)nNOS mRNA高于1.505時(shí),其敏感度為65.8%,特異度為89.3%；當(dāng)iNOS mRNA高于1.795 時(shí),其敏感度為63.2%,特異度為100%；當(dāng)COX-2 mRNA高于1.895時(shí),其敏感度為55.3%,特異度為92.9%.見表4和圖5.

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

表2 各組一般資料比較(n,mean±SD)

圖1 不同類型胃食管反流病中一氧化氮合酶的表達(dá).nNOS：神經(jīng)元型一氧化氮合酶；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；NERD：非糜爛性胃食管反流??；RE：反流性食管炎；BE：Barrett食管.

3 討論

圖2 不同類型胃食管反流病中環(huán)氧合酶-2的表達(dá).COX-2：環(huán)氧合酶-2；NERD：非糜爛性胃食管反流?。籖E：反流性食管炎；BE：Barrett食管.

近年來(lái)GERD發(fā)病率呈上升趨勢(shì),不但會(huì)引起胃灼熱、胸痛、反酸、吞咽疼痛等消化系統(tǒng)損害,而且還可累及呼吸系統(tǒng),其中BE還可進(jìn)展為食管腺癌,嚴(yán)重危害患者生命健康.目前,GERD的發(fā)生機(jī)制仍存在爭(zhēng)議,以往觀點(diǎn)認(rèn)為GERD是由胃內(nèi)容物反流入食管,使食管腔過度接觸胃液引起食管粘膜損傷導(dǎo)致的.但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中,該觀點(diǎn)并未獲得證實(shí),且臨床上有50%以上的GERD為NERD,內(nèi)鏡下并不表現(xiàn)出食管粘膜損傷[5,6].越來(lái)越多報(bào)道顯示,炎性介質(zhì)介導(dǎo)的食管上皮炎性反應(yīng)是導(dǎo)致GERD的主要病因,并且與食管下括約肌(low esophageal sphincter,LES)功能失調(diào)、并發(fā)食管裂孔疝及食管動(dòng)力障礙等有關(guān)[7-9].

表3 各組患者一氧化氮合酶mRNA、環(huán)氧合酶-2mRNA表達(dá)水平比較(mean±SD)

表4 神經(jīng)元型一氧化氮合酶mRNA、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA與環(huán)氧合酶-2 mRNA水平診斷非糜爛性胃食管反流病的受試者工作特征結(jié)果

圖3 神經(jīng)元型一氧化氮合酶mRNA與環(huán)氧合酶-2mRNA的相關(guān)性分析.nNOS：神經(jīng)元型一氧化氮合酶；COX-2：環(huán)氧合酶-2.

圖4 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA與環(huán)氧合酶-2 mRNA的相關(guān)性.iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；COX-2：環(huán)氧合酶-2.

圖5 神經(jīng)元型一氧化氮合酶mRNA、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA與環(huán)氧合酶-2 mRNA水平診斷非糜爛性胃食管反流病的受試者工作特征曲線. nNOS：神經(jīng)元型一氧化氮合酶；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；COX-2：環(huán)氧合酶-2；ROC：受試者工作特征.

NOS是介導(dǎo)NO生成的酶,NO為腸神經(jīng)系統(tǒng)非膽堿能神經(jīng)、非腎上腺素能的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì),可調(diào)節(jié)LES功能和食管動(dòng)力[10].但NO半衰期非常短,測(cè)量難度較大,因此本研究以NOS水平來(lái)反映NO水平.NOS根據(jù)其活性可分為誘導(dǎo)型(induced NOS,iNOS)和基本型(construction NOS,cNOS),而cNOS又可分為神經(jīng)元型NOS (neuron NOS,nNOS)和內(nèi)皮細(xì)胞型NOS (endothelial cell,eNOS).因食管興奮主要受神經(jīng)元支配,尤以LES神經(jīng)支配中的抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為主,故在本研究中在cNOS的選擇中將nNOS納入研究指標(biāo).本研究中,3種不同類型GERD的NOS mRNA (nNOS mRNA、iNOS mRNA)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,且BE組NOS mRNA表達(dá)水平顯著高于RE組,RE組NOS mRNA表達(dá)水平顯著高于NERD組.提示nNOS、iNOS可能共同調(diào)節(jié)LES神經(jīng)支配的抑制性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,引起食管平滑肌功能障礙,從而加重GERD.筆者認(rèn)為其原因?yàn)镹OS高表達(dá)可引起NO含量升高,而NO可調(diào)節(jié)食管括約肌張力,NO含量升高可引起括約肌松弛[11].RE胃食管粘膜損傷較NERD嚴(yán)重,出現(xiàn)糜爛癥狀,因此NOS表達(dá)水平較高,而BE患者有些細(xì)胞開始大量增殖,病變嚴(yán)重,故NOS表達(dá)水平最高.

GERD的發(fā)生發(fā)展與炎性因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切,特別是食管粘膜中的促炎性因子.COX-2是在炎性反應(yīng)組織中高表達(dá),而在正常組織中組織炎性反應(yīng)低表達(dá)或不表達(dá)的一種蛋白,不僅是免疫白細(xì)胞的趨化因子,合成產(chǎn)物前列腺素E 2與組織炎性反應(yīng)直接相關(guān),而且可降低神經(jīng)纖維的閾電位[12].楊梅[13]在不同類型胃食管反流病患者病變組織中COX-2表達(dá)與患者血清炎性因子水平關(guān)系研究中表示,COX-2與腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL) -1β、IL-6、IL-8等促炎癥因子呈顯著正相關(guān).本研究結(jié)果中,3種不同類型GERD的COX-2 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,且BE組COX-2 mRNA表達(dá)水平最高,RE組次之,NERD組最少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與上述研究結(jié)果一致.究其原因可能為COX-2定向趨化胃食管粘膜白細(xì)胞,誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)入感染區(qū)域,并且可合成前列腺素E 2,發(fā)揮促炎作用,從而加重炎癥組織損傷,導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[14,15].BE患者中COX-2表達(dá)水平最高,是因?yàn)锽E組織病變較為嚴(yán)重,進(jìn)一步可能發(fā)展為癌癥,而COX-2高表達(dá)被認(rèn)為早期癌變事件,因此BE患者中COX-2表達(dá)水平最高；RE與NERD的主要區(qū)別在是否出現(xiàn)胃食管粘膜糜爛,RE胃食管粘膜糜爛,炎癥較為嚴(yán)重,故COX-2表達(dá)更高.

通過Person相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),NOS與COX-2表達(dá)呈顯著正相關(guān),提示NOS、COX-2可能共同參與了食管黏膜炎癥反應(yīng)和食管下括約肌功能的調(diào)節(jié),協(xié)同促進(jìn)食管黏膜損傷.NERD是最常見的GERD,但由于在胃鏡下沒有明確的食管損傷,故在診斷上有一定難度,筆者研究中發(fā)現(xiàn)在不同類型的GERD組織中,NOS與COX-2表達(dá)水平不同,因此推測(cè)NOS、COX-2對(duì)NERD的診斷有一定價(jià)值.本研究經(jīng)過ROC曲線分析顯示,nNOS mRNA診斷NERD的AUC為0.662,iNOS mRNA診斷NERD的AUC為0.671,COX-2 mRNA診斷NERD的AUC為0.613,提示NOS與COX-2對(duì)NERD的診斷有一定價(jià)值,但價(jià)值有限,可能通過聯(lián)合診斷增強(qiáng)其診斷價(jià)值.

4 結(jié)論

綜上所述,NOS、COX-2在不同類型GERD中均呈高表達(dá),其中在BE患者中表達(dá)最高,RE患者中表達(dá)次之,NERD患者中表達(dá)最少,并且對(duì)NERD的診斷有一定參考價(jià)值.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

隨著人民生活水平、飲食習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變,胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)在臨床較為常見,近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì),已嚴(yán)重影響到民眾身心健康.GERD包括非糜爛性胃食管反流病(non-erosive reflux disease,NERD)、反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)、Barrett食管(barrett esophageal,BE)三種,其中RE、BE可通過胃鏡、病理進(jìn)行可靠診斷,但NERD食管損傷不明顯,診斷有一定難度.已有研究表明,一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase,NOS)、環(huán)氧合酶-2 (cyclooxygenase-2,COX-2)在GERD發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,但在不同類型GERD方面報(bào)道較少,亟待完善與充實(shí).

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

NOS、COX-2與GERD有關(guān)已在諸多研究中被證實(shí),但在不同類型GERD中的表達(dá)報(bào)道較少,現(xiàn)有的胃鏡對(duì)NERD診斷效果較差,食管pH對(duì)NERD的分型也有難度.因此本研究分析NOS、COX-2在不同類型GERD中的表達(dá),為NERD的早期診斷提供參考.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探究NOS、COX-2在不同類型胃食管反流病中的表達(dá)及意義.

實(shí)驗(yàn)方法

選取行內(nèi)鏡檢查的門診及住院患者,并依據(jù)食管pH監(jiān)測(cè)和病理學(xué)檢查結(jié)果分為NERD組、RE組、及BE組；同時(shí)選取本院門急診及體檢中心進(jìn)行內(nèi)鏡檢查的26例健康人群作為對(duì)照組.分別比較各亞組NOS mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)水平,資料采用SPSS 22.0處理.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

NOS、COX-2在不同類型GERD中均呈高表達(dá),其中在BE患者中表達(dá)最高,RE患者中表達(dá)次之,NERD患者中表達(dá)最少,所有組間比較均存在顯著差異,且NOS、COX-2呈顯著正相關(guān),提示NOS、COX-2相互促進(jìn),參與GERD進(jìn)程,據(jù)此筆者進(jìn)一步分析顯示NOS、COX-2對(duì)NERD有一定診斷價(jià)值.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

NOS、COX-2對(duì)GERD的分型有參考價(jià)值,對(duì)提高臨床GERD診療有一定意義.

展望前景

本研究不足之處在樣本量較小,研究中心單一,且未對(duì)NOS、COX-2參與炎性反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行分析,仍需進(jìn)行大樣本量、多中心的試驗(yàn),進(jìn)一步明確GERD的發(fā)病機(jī)制.為新藥的研究提供參考.