外泌體作為靶向治療載體的研究進(jìn)展

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海201508

外泌體特指通過晚期多泡體（multivesicular bodies，MVB）與質(zhì)膜融合后分泌的磷脂雙分子層包裹的直徑為80～150 nm的囊泡，形態(tài)特征為“cup”狀，最初是在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞的上清中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是細(xì)胞消除不必要蛋白的機(jī)制［1］。后來研究［2］發(fā)現(xiàn)，外泌體可以傳遞功能分子如核酸、蛋白、脂質(zhì)等到靶細(xì)胞并發(fā)揮功能。2013年諾貝爾獎(jiǎng)?lì)C給了在囊泡運(yùn)輸領(lǐng)域有重大貢獻(xiàn)的科學(xué)家。外泌體作為細(xì)胞間交流方式的發(fā)現(xiàn)，不僅為很多生理或疾病過程提供了新解釋［3］，而且還被開發(fā)為載體治療和疾病診斷的工具。

1 外泌體的生理過程

雖然外泌體也有質(zhì)膜來源的大小和功能相同的細(xì)胞外囊泡［4］，但是目前的研究主要集中在以CD63和CD9為標(biāo)志物的內(nèi)體來源的外泌體，專門研究質(zhì)膜來源的細(xì)胞外囊泡的研究較少。外泌體的產(chǎn)生過程：由鞘磷脂酶（sphingomyelinase，SMase）和內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺促進(jìn)MVB內(nèi)部的囊泡形成，之后MVB與細(xì)胞膜融合分泌外泌體。外泌體的分泌需要二磷酸腺苷核糖基化因子6（adenosine diphosphate ribosylation factor 6，ARF6）［5］、Rab27a/b［6-7］和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的解聚［8-9］，液泡三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶介導(dǎo)的MVB酸化可能是外泌體分泌的特異性控制機(jī)制［10］。外泌體被攝取和運(yùn)輸內(nèi)容物到靶細(xì)胞的過程還沒有確切的定論。外泌體與靶細(xì)胞之間特異性的、非特異性的和隨機(jī)的結(jié)合甚至跨物種的結(jié)合有結(jié)論支持［2］。雖然對外泌體的生命過程還未完全闡明，但是基于外泌體的各種研究和應(yīng)用發(fā)展迅速。

2 外泌體的應(yīng)用

目前外泌體的應(yīng)用有許多。在診斷領(lǐng)域，Goldie等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在所有的小RNA中，miRNA在外泌體中所占的比例比它們的來源細(xì)胞更高。血清中長鏈非編碼RNA HOTAIR可作為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新型診斷和預(yù)后標(biāo)志物［12］；外泌體與癌癥相關(guān)的研究［13］發(fā)現(xiàn)，來自鼻咽癌的外泌體攜帶轉(zhuǎn)移相關(guān)的miR-23a通過抑制全新的靶基因TSGA10來介導(dǎo)血管生成。吉西他濱抗性細(xì)胞通過外泌體傳遞miRNA-222-3p轉(zhuǎn)移其惡性特征［14］。最近的研究［15］也表明，化療藥物紫杉醇和多柔比星，可以促進(jìn)腫瘤釋放外泌體，改變肺的微環(huán)境，促進(jìn)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移。還有研究［16］發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體膜表面表達(dá)程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）抑制免疫反應(yīng)，保護(hù)腫瘤細(xì)胞的生長。與免疫相關(guān)的研究［17］顯示，T細(xì)胞通過轉(zhuǎn)移外泌體DNA啟動(dòng)樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），支持抗原依賴性接觸和在保護(hù)DC免受病原體感染方面發(fā)揮特定作用。來自活化中性粒細(xì)胞的外泌體是導(dǎo)致慢性阻塞性肺病的致病元兇［18］。外泌體作為親本細(xì)胞的“信使”，“忠誠”地履行著親本細(xì)胞賦予的使命，例如在致病細(xì)胞中可作為致病實(shí)體［18］或防御手段［16］，在正常細(xì)胞中可作為細(xì)胞間交流的機(jī)制，發(fā)揮積極的作用。

在靶向治療應(yīng)用方面，雖然對外泌體的靶向運(yùn)輸機(jī)制還不完全了解，但是外泌體作為靶向治療載體的概念已被廣泛接受并在動(dòng)物模型中獲得成功。例如，Alvarez-Erviti等［19］靜脈注射靶向小鼠大腦的外泌體可以改善小鼠的阿爾茨海默病，Ohno等［20］靜脈注射攜帶miRNA藥物的外泌體靶向治療表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）高表達(dá)的乳腺癌。Kamerkar等［21］利用外泌體靶向KRAS突變的胰腺癌，顯著抑制腫瘤的生長。Yang等［22］利用細(xì)胞納米穿孔技術(shù)產(chǎn)生了比傳統(tǒng)方法多50倍的外泌體，解決了限制外泌體應(yīng)用中產(chǎn)量不足的難題。外泌體的靶向治療在實(shí)驗(yàn)室取得的初步成果也引起了商業(yè)公司的關(guān)注。目前外泌體靶向改造較為成熟的有瑞士Roche公司和美國PureTech Health公司的乳源外泌體平臺(tái)技術(shù)和美國Codiak公司的engExTM精密外泌體工程平臺(tái)。在臨床試驗(yàn)方面，關(guān)于外泌體靶向治療的臨床試驗(yàn)較少，通過美國臨床試驗(yàn)登記系統(tǒng)查詢，目前僅有1例外泌體靶向治療試驗(yàn)進(jìn)入Ⅲ期臨床階段，啟動(dòng)時(shí)間為2014年，目前狀態(tài)為未知。進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)的有3例，目前正在進(jìn)展的項(xiàng)目有：植物來源的外泌體攜帶姜黃素來治療結(jié)直腸癌已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。

3 外泌體與靶向治療

3.1 外泌體作為靶向治療載體的優(yōu)勢

外泌體和脂質(zhì)體與納米材料載體相比有很多優(yōu)勢，例如：低免疫原性，來源于D C的外泌體含有主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子［23］，因此不會(huì)被免疫細(xì)胞清除；半衰期長，外泌體表面高表達(dá)CD47蛋白［21］，CD47蛋白是一種廣泛表達(dá)的整聯(lián)蛋白相關(guān)跨膜蛋白，是信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）的配體，CD47-SIRPα結(jié)合引發(fā)“不要吃我”抑制吞噬作用的信號(hào)［24］，可以防止外泌體被單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬，增加外泌體在體內(nèi)的半衰期；外泌體還具有穿透血腦屏障、胎盤屏障的能力［19］；外泌體可以與傳統(tǒng)的病毒載體結(jié)合使用，形成一種功能更強(qiáng)的基因治療工具，如Orefice等［25］利用外泌體包裹腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體來靶向治療神經(jīng)退行性疾病，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得了良好的效果，為腦部疾病的治療帶來了希望。外泌體載體的以上優(yōu)勢吸引了越來越多的研究者去研究外泌體載體，拓展了外泌體載體的應(yīng)用范圍。

3.2 外泌體作為靶向治療載體的基礎(chǔ)

外泌體在細(xì)胞間的通訊交流中扮演著重要角色，在人體中，外泌體攜帶著蛋白、核酸和脂質(zhì)等大量生命信息，需要遵循人體運(yùn)行的有序性，否則必然會(huì)導(dǎo)致人體信息傳遞的錯(cuò)亂，破壞人體功能的平衡，所以有理由相信外泌體在體內(nèi)是靶向運(yùn)輸?shù)?，這為開發(fā)外泌體的靶向改造提供了可能性。Alvarez-Erviti等［19］通過改造產(chǎn)生外泌體的母細(xì)胞，使其分泌的外泌體膜表面產(chǎn)生靶向目標(biāo)細(xì)胞的蛋白，從而使外泌體產(chǎn)生所需的靶向性，證明可以對外泌體進(jìn)行靶向性改造。之后越來越多的研究涌向外泌體的靶向治療領(lǐng)域。

3.3 外泌體的靶向性改造技術(shù)

外泌體的產(chǎn)生受親本基因的控制，通過基因工程手段導(dǎo)入融合歸巢蛋白和外泌體的轉(zhuǎn)膜蛋白的基因到親本細(xì)胞中，使得想要的蛋白展示在外泌體膜表面。對外泌體進(jìn)行靶向改造的過程就是膜蛋白展示的過程。目前已經(jīng)驗(yàn)證的轉(zhuǎn)膜蛋白和歸巢蛋白的組合見表1［26］。

歸巢蛋白與在外泌體膜表面已知富集的跨膜蛋白融合，從而展示在外泌體膜表面。對于利用乳凝集素C1C2結(jié)構(gòu)域作為錨定點(diǎn)的組合，因?yàn)槟厥悄は嚓P(guān)蛋白，而不是跨膜蛋白，所以使用凝集素C1C2結(jié)構(gòu)域作為外泌體膜表面的錨點(diǎn)沒有利用外泌體的轉(zhuǎn)膜蛋白可信［34］。以下簡要介紹溶酶體相關(guān)膜蛋白2（lysosomal-associated membrane protein，Lamp2）和血小板衍生的生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）的研究。Alvarez-Erviti等［19］利用未成熟的DC作為工程化外泌體的來源，通過將狂犬病毒糖蛋白（rabies viral glycoprotein，RVG）基因和一種在外泌體膜表面富集的Lamp2b基因融合，然后利用載體轉(zhuǎn)染未成熟的DC，獲得表面表達(dá)融合蛋白的外泌體，靶向神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿受體，將RVG和Lamp2b的基因融合克隆到載體上并轉(zhuǎn)染未成熟的DC，被展示在外泌體表面的Lamp2b-RVG蛋白將會(huì)靶向神經(jīng)細(xì)胞。提純之后的外泌體利用電穿孔的方法裝載GAPDH-siRNA，靜脈注射結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠腦中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中的GAPDH基因被敲除，預(yù)暴露于RVG-外泌體并沒有導(dǎo)致敲除削弱，除腦以外的其他組織中并未發(fā)現(xiàn)非特異性的敲除。使用外泌體裝載siRNA靶向治療阿爾茨海默病在小鼠實(shí)驗(yàn)中獲得了較好的結(jié)果，與野生型小鼠相比較，靶向治療組的小鼠體內(nèi)的β分泌酶1（β-secretase 1，BACE1）的60%水平的mRNA和62%水平的蛋白質(zhì)被敲除。證明外泌體不僅可以獲得性地形成靶向性而且可以穿透血腦屏障，已在治療阿爾茨海默病方面顯示出巨大潛力。

Ohno等［20］利用HEK-293細(xì)胞作為外泌體的來源，利用特殊的pDisplay載體攜帶靶向基因轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。利用表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和GE11多肽靶向EGFR高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法使外泌體加載siRNA（let-7a miRNA）。pDisplay載體中含有PDGFR跨膜區(qū)域，將會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)在質(zhì)膜上的表達(dá)。融合基因中設(shè)置血細(xì)胞凝集素（hemagglutinin，HA）抗體基因標(biāo)簽，以便于后續(xù)的檢測和篩選。GE11是通過噬菌體展示技術(shù)篩選出的一種含有11個(gè)氨基酸殘基的多肽，能高效地靶向結(jié)合于細(xì)胞膜表面的EGFR受體。該實(shí)驗(yàn)靶向性獲得的策略延續(xù)了上述研究，但是該研究利用電穿孔法并不能成功的裝載siRNA到外泌體，作者認(rèn)為可能是由于細(xì)胞類型不同，分泌的外泌體也有差異。

表1 用于外泌體膜表面展示的與跨膜結(jié)構(gòu)域融合的功能肽Tab.1 Functional peptides fused with transmembrane domains for exosome membrane surface display

通過轉(zhuǎn)膜蛋白和歸巢蛋白相融合的策略能將多肽展示在外泌體膜表面，但是也會(huì)有一些問題，例如，展示在外泌體膜表面的歸巢肽有時(shí)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)或體液中的蛋白酶降解從而失去其靶向性，在有靶向性的多肽的N端，利用工程手段加入一個(gè)糖基化多肽序列GNSTM可以保護(hù)靶向多肽免遭蛋白酶降解，增加在細(xì)胞和外泌體中的表達(dá)，增強(qiáng)外泌體對靶細(xì)胞的靶向能力。另一方面，如果歸巢肽相對分子質(zhì)量太大，當(dāng)其和膜蛋白融合的時(shí)候，會(huì)干擾融合蛋白的表達(dá)或正確折疊，因此尋找受體的核心短片段，盡量減少歸巢肽的相對分子質(zhì)量對于解決外泌體作為靶向治療載體的靶向性難題具有重要意義。

3.4 外泌體的裝載技術(shù)

3.4.1 核酸藥物的裝載

外泌體內(nèi)部包含miRNA、RNA、DNA和其他非編碼RNA，說明外泌體具有對核酸藥物的天然包容性，目前外泌體裝載治療性的miRNA的研究相對較多，詳見表2。

表2 外泌體裝載核酸藥物的方法Tab.2 Method for loading exosomes with nucleic acid drugs

電穿孔法一直被用來處理細(xì)胞，是一種高效、經(jīng)濟(jì)的膜穿孔方法，在外泌體裝載負(fù)荷時(shí)也被證明是可行的，但是該方法目前被發(fā)現(xiàn)存在一定的缺陷，例如，Kooijmans等［37］認(rèn)為電穿孔可能會(huì)導(dǎo)致siRNA的聚集并隨外泌體共同沉降，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，當(dāng)無外泌體存在時(shí)，siRNA在經(jīng)過電穿孔處理之后，納米粒徑分析和共聚焦顯微鏡揭示比有外泌體存在情況下相等或更多的不溶的siRNA聚合物，這些不溶物將會(huì)隨外泌體一起沉降，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，解決方法可通過在電轉(zhuǎn)緩沖液中加乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）或檸檬酸鹽（更高效）來減少siRNA的聚合。

然而并不是所有細(xì)胞來源的外泌體都可以用電穿孔法，例如，Ohno等［20］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用HEK-293細(xì)胞而不是DC作為外泌體來源的時(shí)候，電穿孔法不能有效地加載siRNA，而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法卻能成功地裝載，研究者認(rèn)為可能是細(xì)胞類型不同導(dǎo)致的，具體原因需進(jìn)一步探究。雖然脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法相對于電穿孔法效率較低，使用的較少，但是當(dāng)有些細(xì)胞不能使用電穿孔法的時(shí)候可作為備用選擇。

Haney等［24］也嘗試?yán)檬覝販赜?、反?fù)凍融、聲波降解和擠壓法來使外泌體裝載過氧化氫酶，發(fā)現(xiàn)裝載效率：室溫溫育＜反復(fù)凍融＜聲波降解≈?jǐn)D壓法，推斷可能是在超聲和擠壓時(shí)形成瞬時(shí)孔或外泌體膜重組使得過氧化氫酶可以從周圍遞質(zhì)中擴(kuò)散到外泌體內(nèi)部。該方法是否也適合miRNA的裝載還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4.2 蛋白質(zhì)的裝載

蛋白質(zhì)藥物相對于基因藥物更直接，但是直接進(jìn)入生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)藥物容易引起免疫反應(yīng)而被清除。自體產(chǎn)生的外泌體不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，其囊泡結(jié)構(gòu)也能保護(hù)藥物蛋白不受體內(nèi)環(huán)境的影響，是一種極具優(yōu)勢的蛋白質(zhì)藥物的載體。目前針對在外泌體中裝載蛋白的研究相對較少，以下簡單介紹目前外泌體裝載蛋白質(zhì)的技術(shù)。

Hong等［41］利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染攜帶PH20透明質(zhì)酸酶基因的質(zhì)粒到HEK-293T細(xì)胞中，在產(chǎn)生的外泌體表面展示該酶，作用于實(shí)體瘤，消化道腫瘤微環(huán)境中過多的細(xì)胞外基質(zhì)，抑制腫瘤生長并增加T細(xì)胞對腫瘤的浸潤。Yim等［42］使用光誘導(dǎo)外泌體裝載治療蛋白，使用藍(lán)光來控制可逆的蛋白與蛋白相互作用模型來影響外泌體內(nèi)吞過程，該研究小組使用感光色素蛋白2（cryptochrome circadian regulator 2，CRY2）和感光色素相互作用的螺旋-環(huán)-螺旋CIBN在450～490 nm波長的藍(lán)光照射時(shí)相互黏在一起的原理，將蛋白治療劑與CRY2相結(jié)合，外泌體與CIBN相結(jié)合，然后用450～490 nm波長的藍(lán)光照射，此時(shí)蛋白質(zhì)治療劑和外泌體將會(huì)結(jié)合在一起。該方法可以將蛋白質(zhì)治療劑的負(fù)載率提高超過1 000倍。而且新技術(shù)不必控制對蛋白質(zhì)治療劑的免疫反應(yīng)，且可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)治療劑到達(dá)靶細(xì)胞，是一種高效的外源蛋白裝載方法。

Sterzenbach等［43］利用晚期（L-domain）途徑形成外泌體的過程中，將外源蛋白裝入外泌體的方法，研究發(fā)現(xiàn)，WW標(biāo)簽標(biāo)記的Cre重組酶蛋白可以被晚期（L-domain）途徑中的Ndfip1蛋白識(shí)別，導(dǎo)致泛素化并被攝入外泌體中。該過程可以被外泌體的抑制劑GW4869所抑制，說明Ndfip1的表達(dá)可作為外泌體裝載WW-Cre蛋白的分子開關(guān)。而且WW-Cre的外泌體能夠在受體細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA重組，表明成功地將外源功能性蛋白質(zhì)遞送到受體細(xì)胞。該方法直接利用外泌體的生成機(jī)制進(jìn)行外源蛋白的裝載，雖然比較便捷高效，但是目前對外泌體的產(chǎn)生機(jī)制尚未完全了解，不確定該方法是否會(huì)產(chǎn)生其他不利的影響。

4 結(jié)語

外泌體的免疫沉默、膜展示系統(tǒng)、具有靶向性和可滲透生物屏障等優(yōu)勢使人們對它在靶向治療方面的應(yīng)用產(chǎn)生了巨大熱情，目前關(guān)于外泌體靶向治療的研究進(jìn)展迅速，但存在一定的局限性，例如，目前多數(shù)關(guān)于外泌體靶向治療的研究中，外泌體僅通過物理方法進(jìn)行質(zhì)控，而沒有考慮其他有類似特征的細(xì)胞外囊泡可能的影響。而且同種細(xì)胞可分泌不同的外泌體，其異質(zhì)性對于臨床應(yīng)用也可能有重要意義。有鑒于此，只有對外泌體的產(chǎn)生、釋放和傳遞過程有更深入的了解，才能使得外泌體的應(yīng)用技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展。隨著分離外泌體的亞類等技術(shù)的成熟，外泌體在生物體中的確切功能必將得到闡明。