蒙藥材多葉棘豆和硬毛棘豆對(duì)比研究

楊立國(guó) 新 紅2 陳香梅1 達(dá)拉胡3 蘇都那布其2 王秀蘭

1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院, 內(nèi)蒙古 通遼 028000;2.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院,內(nèi)蒙古 通遼 028000;3.內(nèi)蒙古通遼市庫(kù)倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000

棘豆屬植物全世界約300余種，主要分布在北半球，我國(guó)約150余種，分布在東北、華北、西北等地[1]。蒙醫(yī)藥中常用的是其中的多葉棘豆和硬毛棘豆，二者均收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-蒙藥分冊(cè)》(1998年版)：多葉棘豆為豆科植物多葉棘豆OxytropismyriophyllaDC.的干燥全草，味苦、甘，性涼、鈍、輕、糙，具有殺“粘”、清熱、燥“協(xié)日烏素”，愈傷、生肌、鎖脈、止血、消腫、通便的功效；硬毛棘豆為豆科植物硬毛棘豆OxytropishirtaBge.的干燥地上部分，味苦、甘，性涼、鈍、輕、糙，具有殺“粘”、清熱、燥“協(xié)日烏素”、愈傷、生肌、鎖脈、止血、消腫、通便的功效[2]。據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，多葉棘豆和硬毛棘豆在臨床上經(jīng)?；煊?如圖1所示)。筆者前期已對(duì)多葉棘豆化學(xué)成分進(jìn)行了綜述[4]，另陳思有等[5]通過DNA條形碼將多葉棘豆和硬毛棘豆進(jìn)行鑒定，但多葉棘豆和硬毛棘豆顯微特征、薄層色譜和HPLC特征圖譜對(duì)比研究，均未見文獻(xiàn)報(bào)道。多葉棘豆和硬毛棘豆總黃酮成分含量對(duì)比研究，僅有1篇文獻(xiàn)[6]報(bào)道。鑒于上述研究現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)擬以多葉棘豆和硬毛棘豆為研究對(duì)象，從顯微特征、薄層色譜、HPLC特征圖譜和總黃酮含量等方面對(duì)多葉棘豆和硬毛棘豆進(jìn)行對(duì)比研究，以期為多葉棘豆和硬毛棘豆的合理應(yīng)用提供參考。

圖1 多葉棘豆(左)和硬毛棘豆(右)

1.1 儀器與材料 Nikon E200電子顯微鏡和DS-U3拍照裝置(北京恒三江儀器有限公司)；多葉棘豆Oxytropismyriophylla和硬毛棘豆Oxytropishirta采自內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥草園，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院標(biāo)本室；水合氯醛、稀甘油均為分析純?cè)噭?/p>

1 顯微特征對(duì)比研究

1.2 方法與結(jié)果 根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2001顯微鑒別法[7]規(guī)定，取多葉棘豆和硬毛棘豆粉末適量，水合氯醛、稀甘油制片進(jìn)行顯微觀察，生物光學(xué)顯微鏡下觀察顯微特征，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，多葉棘豆和硬毛棘豆藥材粉末的導(dǎo)管均為螺紋導(dǎo)管和具緣紋孔導(dǎo)管，直徑約8～45 μm；氣孔為不定式氣孔，類圓形或橢圓形，直徑10～35 μm；纖維多成束，碎斷，壁較厚，直徑8～38 μm；木栓細(xì)胞直徑約18～62 μm，二者(根部)均存在。綜上所述，二者粉末顯微特征基本相似，無(wú)顯著差異，組織切片顯微特征對(duì)比研究待進(jìn)一步開展。

1～4分別為多葉棘豆導(dǎo)管、氣孔、纖維細(xì)胞和木栓細(xì)胞；5～8分別為硬毛棘豆導(dǎo)管、氣孔、纖維細(xì)胞和木栓細(xì)胞圖2 粉末顯微特征對(duì)比(10×40)

2 基于薄層色譜的多葉棘豆和硬毛棘豆對(duì)比研究

2.1 儀器與材料 硅膠G板(青島海洋化工公司)；聚酰胺薄膜(浙江省臺(tái)州市路橋四甲塑料廠)；ZF-02S型紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)限公司)；多葉棘豆Oxytropismyriophylla和硬毛棘豆Oxytropishirta采自內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥草園，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院標(biāo)本室；槲皮素(117-39-5，上海源葉生物科技公司)；異鼠李素(480-19-3，上海源葉生物科技公司)；蘆丁(153-18-4，上海源葉生物科技公司)；乙酸乙酯、甲醇、甲酸、冰醋酸均為分析純?cè)噭?/p>

2.2 方法與結(jié)果 供試品溶液的制備：分別取多葉棘豆和硬毛棘豆1 g，加65%乙醇10 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，備用。

對(duì)照品溶液的制備：分別取槲皮素、異鼠李素、蘆丁0.5 mg，用1 mL甲醇溶解，作為對(duì)照品溶液，備用。

展開與檢視：分別取多葉棘豆、硬毛棘豆、槲皮素、異鼠李素、蘆丁溶液各3 μL，點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，用甲醇-水-冰醋酸=12∶3∶3展開，取出，晾干，365 nm紫外燈下檢視，結(jié)果如圖3所示；分別吸取多葉棘豆、硬毛棘豆溶液各3 μL，點(diǎn)于硅膠G板上，用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15∶1∶1∶2展開，取出，晾干，10%硫酸-乙醇顯色，電吹風(fēng)加熱至斑點(diǎn)清晰，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，多葉棘豆和硬毛棘豆化學(xué)成分均很復(fù)雜，二者化學(xué)成分存在較大差異。

3 基于HPLC特征圖譜的多葉棘豆和硬毛棘豆對(duì)比研究

3.1 儀器與材料 Ultimate 3000高效液相色譜儀(LC-20AT四元泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測(cè)器)；超聲波清洗器SK8200 HP(上?？茖?dǎo)超聲儀器公司)；METTLER-TOLEDO AG-285型電子分析天平(METTLER-TOLEDO有限公司)；多葉棘豆Oxytropismyriophylla和硬毛棘豆Oxytropishirta采自內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥草園，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院標(biāo)本室；乙腈為色譜純；乙酸為分析純；蒸餾水自制。

3.2 方法與結(jié)果 色譜條件：色譜柱為Waters Xterra MS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.4%乙酸水溶液，梯度洗脫程序見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

左-聚酰胺色譜；右-硅膠色譜；1,6-硬毛棘豆，5,7-多葉棘豆，2-槲皮素，3-異鼠李素，4-蘆丁圖3 薄層色譜對(duì)比

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

供試品溶液的制備：分別取多葉棘豆和硬毛棘豆0.5 g，加65%乙醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，取出，放冷，再稱定重量，65%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過。濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

HPLC特征圖譜建立：分別吸取多葉棘豆、硬毛棘豆供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫，得到多葉棘豆和硬毛棘豆HPLC特征圖譜，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，多葉棘豆和硬毛棘豆化學(xué)成分均很復(fù)雜，二者化學(xué)成分存在較大差異。

4 總黃酮含量對(duì)比研究

4.1 儀器與材料 FW-177高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器公司)；752-PC紫外-可見分光光度計(jì)；HW-526數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海恒科學(xué)儀器公司)；BS224 S分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；多葉棘豆Oxytropismyriophylla和硬毛棘豆Oxytropishirta采自內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院藥草園，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院吳香杰教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院標(biāo)本室；蘆丁(153-18-4，上海源葉生物科技公司)；亞硝酸鈉(天津市永大化學(xué)試劑公司)；硝酸鋁(天津市大茂化學(xué)試劑公司)；氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑公司)；95%乙醇(天津市永大化學(xué)試劑公司)；其他試劑均為分析純。

上為硬毛棘豆，下為多葉棘豆圖4 HPLC特征圖譜對(duì)比

4.2 方法[8]與結(jié)果

4.2.1 供試品溶液的制備 分別取粉碎過40目的多葉棘豆和硬毛棘豆藥材粉末各5 g，加入50 mL 65%乙醇，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，搖勻，即得供試品溶液。

4.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定10.08 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，加65%乙醇溶解，稀釋至刻度，配制成0.2 mg/mL對(duì)照品溶液，冷藏備用。

4.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 從不同濃度(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL、0.12 mg/mL)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液中精密量取1 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min后，再加入10%硝酸鋁0.3 mL，再靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉試液4 mL，加入65%乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min。采用紫外-可見分光光度法，以65%乙醇為參比溶液，在510 nm處測(cè)吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=11.49X+0.0179，r2= 0.9990。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖5所示。

圖5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.2.4 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：精密吸取多葉棘豆供試品溶液1 mL，照“4.2.3”項(xiàng)下制備方法顯色并測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.36%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：在室溫下，精密吸取多葉棘豆供試品溶液1 mL，照“4.2.3”項(xiàng)下制備方法顯色后，放置0、5、10、15、20、25 min后測(cè)定其吸光度，計(jì)算RSD為2.29%，表明供試品溶液在25 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批多葉棘豆藥材，照供試品溶液的制備方法制得6份供試品溶液，各取1 mL，照“4.2.3”項(xiàng)下制備方法顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算所得總黃酮的平均含量為0.332 mg/g，RSD為2.54%。表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：精確吸取已知含量的多葉棘豆供試品溶液0.5 mL，共6份，分別加0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，照“4.2.3”項(xiàng)下制備方法顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。平均回收率為94.66%，RSD為2.46%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.2.5 多葉棘豆和硬毛棘豆總黃酮含量測(cè)定 分別稱取多葉棘豆5.0228 g和硬毛棘豆5.0218 g，按照前述方法測(cè)定多葉棘豆和硬毛棘豆中總黃酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多葉棘豆中總黃酮含量為0.552 mg/g，硬毛棘豆中總黃酮含量為0.793 mg/g。

表3 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

5 討論

多葉棘豆和硬毛棘豆分別為豆科植物多葉棘豆OxytropismyriophyllaDC.和硬毛棘豆OxytropishirtaBge.的干燥全草，二者均具有殺“粘”、清熱、燥“協(xié)日烏素”、愈傷、生肌、鎖脈、止血、消腫、通便的功效，且二者在臨床上經(jīng)?；煊肹2-3]。本實(shí)驗(yàn)從顯微特征、TLC、HPLC特征圖譜和總黃酮含量四方面對(duì)多葉棘豆和硬毛棘豆進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)：①多葉棘豆和硬毛棘豆藥材粉末顯微特征無(wú)顯著性差異；②二者的薄層色譜存在顯著差異，硬毛棘豆化學(xué)成分更為復(fù)雜；③二者的HPLC特征圖譜也存在不小差異，總體上講，硬毛棘豆化學(xué)成分更為復(fù)雜，這與薄層色譜顯示結(jié)果一致；④總黃酮含量方面，硬毛棘豆總黃酮含量(0.793 mg/g)高于多葉棘豆總黃酮含量(0.552 mg/g)。綜上所述，多葉棘豆和硬毛棘豆在化學(xué)成分方面存在著一定的差別，建議臨床醫(yī)生謹(jǐn)慎選用。

另外，多葉棘豆和硬毛棘豆在蒙醫(yī)臨床中應(yīng)用廣泛[9]，但二者現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)仍為1998版蒙藥分冊(cè)部頒標(biāo)準(zhǔn)，急需完善更新[10-11]，本研究可為二者質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂完善工作提供一定的參考。