人溶菌酶密碼子優(yōu)化及其在牛乳腺細(xì)胞中高效表達(dá)

田媛，王力，龍鳳，昝林森,2，成功,2

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2國(guó)家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100）

0 引言

【研究意義】抗生素濫用所引發(fā)的細(xì)菌耐藥性、抗生素殘留及食品安全等問(wèn)題已被視為全球危害公眾健康的問(wèn)題，人們迫切需要開(kāi)發(fā)新型廣譜抗菌劑。溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，在唾液、淚液、血清、人乳、牛乳和禽類蛋清中廣泛分布，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，具有廣譜抗菌、消炎、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種功效，在畜牧、農(nóng)產(chǎn)品、食品和醫(yī)療等行業(yè)廣泛應(yīng)用[1-3]。人溶菌酶和雞蛋清溶菌酶氨基酸序列具有59%同源性，但抗菌活性遠(yuǎn)高于目前使用較廣的雞蛋清溶菌酶，具有更廣闊的應(yīng)用前景[4]。然而，通過(guò)傳統(tǒng)方法從母乳、胎盤、唾液中提取分離或微生物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人溶菌酶，獲得量很少，穩(wěn)定性低，無(wú)法滿足研究和潛在市場(chǎng)應(yīng)用的需求[5]?；蚬こ滩粩喟l(fā)展為大規(guī)模高效生產(chǎn)重組人溶菌酶提供了可能。因此，進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)重組人溶菌酶高效表達(dá)，將為今后重組人溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】2006年，MEGA首次利用山羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)了重組人溶菌酶[6]，隨后在牛[7-9]、豬[10]、山羊[11]等動(dòng)物的研究中均有成功實(shí)現(xiàn)了重組人溶菌酶在乳腺中表達(dá)的報(bào)道。然而，不容忽視的是，異源重組蛋白表達(dá)量低是目前生物反應(yīng)器中亟待解決的難題。研究發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞密碼子使用偏好很大程度上影響了異源重組蛋白在宿主細(xì)胞的高效表達(dá)[12]。組成蛋白質(zhì)的氨基酸有 20種，而編碼氨基酸的密碼子有64種（簡(jiǎn)并密碼子）。不同生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛(ài)性，其中使用頻率高密碼子稱為最佳密碼子，而那些很少被利用的密碼子稱為稀有或低頻密碼子。研究發(fā)現(xiàn)，少量的 DNA密碼子的改變，在很大程度上影響了蛋白翻譯速率，即使替換單個(gè)簡(jiǎn)并密碼子，其蛋白合成的速度會(huì)減緩到其正常速度的1/10甚至更慢[13]，密碼子使用偏好與蛋白翻譯效率呈顯著正相關(guān)[14]。通過(guò)蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，密碼子的選擇決定了蛋白的表達(dá)量，生物體通過(guò)密碼子的選擇進(jìn)而調(diào)控內(nèi)源蛋白的表達(dá)豐度[15]。密碼子的選擇在生物反應(yīng)器研究過(guò)程中十分重要，外源基因含有宿主細(xì)胞基因使用的低頻密碼子或者偏好密碼子不一致情況下，往往會(huì)影響外源基因的mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，造成重組蛋白表達(dá)量低[16]。前人研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因山羊、牛乳腺中重組人乳鐵蛋白表達(dá)量為 1.5—30 g·L-1，而重組人溶菌酶的表達(dá)量只有0.025—0.27 g·L-1[17]，表達(dá)量低造成提純成本高，難以達(dá)到乳腺生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)要求?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】因此，人溶菌酶基因密碼子使用偏好性是否與牛主要乳蛋白密碼子使用偏好一致？這種差異是否是導(dǎo)致人溶菌酶在乳腺生物反應(yīng)器中表達(dá)量低的主要原因？密碼子優(yōu)化能否進(jìn)一步提高重組人溶菌酶表達(dá)量？這些問(wèn)題仍待進(jìn)一步研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牛乳腺主要乳蛋白密碼子使用偏好性進(jìn)行分析，并根據(jù)牛乳蛋白高頻密碼子和低頻密碼子對(duì)人溶菌酶基因密碼子進(jìn)行翻譯起始區(qū)優(yōu)化和全局優(yōu)化設(shè)計(jì)，通過(guò)熒光素酶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-blot等方法從mRNA和蛋白水平對(duì)密碼子優(yōu)化效果進(jìn)行分析比較，實(shí)現(xiàn)人溶菌酶基因的高效表達(dá)，為開(kāi)展重組人溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2019年在西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

PGL3-Basic熒光素酶載體、海腎熒光素酶載體為實(shí)驗(yàn)室保存。E.coliDH 5a菌株和pMD19-T easy載體購(gòu)自大連Takara公司。牛成纖維細(xì)胞通過(guò)耳組織塊法分離獲得，實(shí)驗(yàn)室凍存。牛乳腺上皮細(xì)胞系購(gòu)自通派（上海）生物科技有限公司，小鼠乳腺上皮細(xì)胞系C127購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。主要試劑包括：高保真PCR酶、限制性內(nèi)切酶、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix EX Taq定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA連接酶、Dual-Glo雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；Endo-free Plasmid Kit、膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Biotek股份有限公司；Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑及 opti-MEM 購(gòu)自Invitrogen公司；Western-blot細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒及SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自羅氏公司。兔源溶菌酶多抗、兔源GAPDH單抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗分別購(gòu)自Santa Cruz（sc-292849），Abcam（ab181603）和生工生物工程（上海）股份有限公司（D110058）。

1.2 牛主要乳蛋白基因和人溶菌酶基因密碼子使用偏好分析

選取 αs1、αs2、β、κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳清白蛋白，乳鐵蛋白等7種牛乳中主要乳蛋白基因CDS序列，用于密碼子使用偏好性分析。具體乳蛋白基因名稱、GenBank登錄號(hào)、CDS序列長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 7種牛乳蛋白基因GenBank登錄號(hào)及序列信息Table 1 GenBank accession number and sequence information of cattle seven milk protein genes

利用 CodonW1.42和 EMBOSS（http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/）中CUSP、CHIPs等工具對(duì)牛主要乳蛋白基因密碼子及人溶菌酶密碼子使用特性進(jìn)行分析。分析的特性參數(shù)主要包括：A3s，G3s，C3s，同義密碼子在第 3 位上相應(yīng)堿基的出現(xiàn)頻率（T3s）、基因的G+C含量（GC）、密碼子第3位的G+C 含量（GC3s）、密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）、有效密碼子數(shù)（ENc）等。同義密碼子的相對(duì)使用度（RSCU）是對(duì)同義密碼子的使用偏好性評(píng)估，該值等于同義密碼子的實(shí)際觀測(cè)值與同義密碼子平均使用期望值的比值。如果密碼子使用無(wú)偏好性，則RSCU值為1；如該密碼子比其他同義密碼子使用更頻繁，則其 RSCU值大于1，反之亦然。將7個(gè)牛乳蛋白基因和人溶菌酶基因各自作為一個(gè)對(duì)象，以密碼子的RSCU 值作為變量，對(duì)應(yīng)每個(gè)編碼氨基酸密碼子利用TBtools 0.665繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析。

1.3 溶菌酶密碼子優(yōu)化及基因克隆

根據(jù)牛主要乳蛋白基因密碼子使用偏好性，對(duì)人溶菌酶基因局部（翻譯起始區(qū)前22位密碼子）和全局優(yōu)化設(shè)計(jì)。利用mfold在線軟件對(duì)優(yōu)化后的人溶菌酶基因序列進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析（http://unafold.rna.albany.edu/）。

采用Trizol 法提取人Hela細(xì)胞總RNA, 通過(guò)凝膠電泳和核酸定量檢測(cè) RNA質(zhì)量和濃度。根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，利用P-pGL3-cw引物（表 2）克隆獲得人溶菌酶編碼區(qū)序列（野生型溶菌酶序列，LYZcw）。反應(yīng)條件為：98 ℃，30 s模板變性；98℃，5 s；57℃，15 s；72℃，15 s，30個(gè)循環(huán)。72℃，5 min延伸。以LYZcw cDNA為模板，利用P-pGL3-op22引物（表2）克隆獲得翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化序列（LYZop22），PCR反應(yīng)條件同上。對(duì)上述獲得的LYZcw、LYZop22PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收純化、序列末端加A反應(yīng)、T-A克隆并DH5α轉(zhuǎn)化后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證（LYZcw-T、LYZop22-T）。全局密碼子優(yōu)化的溶菌酶序列（LYZop），經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成并克隆到 T載體中（LYZop-T）。

表2 LYZcw、LYZop22、LYZop序列克隆引物信息及基因合成Table 2 Primers for the amplication of LYZcw, LYZop22 and LYZop

1.4 pGL3-LYZcw/op22/op溶菌酶-熒光素酶融合表達(dá)構(gòu)建

以Invitrogen公司pGL3-control載體為骨架載體，構(gòu)建人溶菌酶基因與螢火蟲熒光素酶基因融合表達(dá)載體。通過(guò)NcoI內(nèi)切酶分別酶切LYZcw-T、LYZop22-T、LYZop- T和pGL3-control載體。1%瓊脂糖凝膠電泳回收LYZcw、LYZop22、LYZop溶菌酶基因序列和線性化的pGL3-control載體。通過(guò)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，分別構(gòu)建pGL3-LYZcw/op22/op熒光素酶融合表達(dá)載體。測(cè)序篩選鑒定LYZcw/op22/op序列以正向插入并與螢火蟲熒光素酶基因正確融合的質(zhì)粒用于下一步研究。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶檢測(cè)密碼子優(yōu)化效果

分別將實(shí)驗(yàn)室凍存的牛乳腺上皮細(xì)胞系（BMEC）、牛成纖維細(xì)胞（BFFC）及C127小鼠乳腺上皮細(xì)胞系復(fù)蘇，用完全培養(yǎng)基（DMEM高糖+10% FBS +1% PS）重懸，接種到T75培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到 90%時(shí)進(jìn)行傳代接種于24孔培養(yǎng)板中（2×105/孔）。接種后的第二天，按照每孔 0.8 μg質(zhì)粒（PGL-LYZcw/LYZop/LYZop22∶pRL-tk = 10∶1）：2 μLlipo3000比例轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，每組4個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)比較人溶菌酶密碼子優(yōu)化效果。

1.6 pcDNA3.1-LYZcw/op22/op溶菌酶過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

分別以pGL3-LYZcw/op22/op質(zhì)粒為模板，利用P-pcDNA-cw、P-pcDNA-op22、P-pcDNA-op引物（表2）克隆LYZcw、LYZop22、LYZop序列（PCR反應(yīng)條件參照1.3）并連接到T載體。使用HindIII、XhoI內(nèi)切酶分別酶切pcDNA3.1（+）、LYZcw-T、LYZop22-T vector、LYZop- T，連接構(gòu)建 pcDNA-LYZcw/op22/op人溶菌酶過(guò)表達(dá)載體，測(cè)序做進(jìn)一步鑒定。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)密碼子優(yōu)化效果

將培養(yǎng)的牛成纖維細(xì)胞（BFFC）、牛乳腺上皮細(xì)胞（BMEC）及C127細(xì)胞傳代接種于12孔培養(yǎng)板中（2×105/孔）。接種后的第二天，按照l(shuí)ipo3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，每孔 1.6 μg質(zhì)粒（pcDNA 空載、pcDNA-LYZcw/op22/op）：4 μL lipo3000 比例轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，每組4個(gè)復(fù)孔。24 h后按照1.3中方法提取細(xì)胞總 RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，用于下一步定量PCR檢測(cè)。

對(duì)不同密碼子優(yōu)化方式對(duì)重組人溶菌酶 mRNA水平表達(dá)量進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃，30 s。95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，確保擴(kuò)增條帶單一。

1.8 Western-blot檢測(cè)密碼子優(yōu)化效果

將培養(yǎng)的牛乳腺細(xì)胞（BMEC）經(jīng)胰酶消化后接種于6孔培養(yǎng)板中（4×105/ 孔）。接種后的第二天，按照 lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，每孔 4.0 μg質(zhì)粒（pcDNA 空載、pcDNA-LYZcw/op22/op）：10 μL lipo3000比例轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，每組4個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后，收集蛋白用于Western-blot檢測(cè)。蛋白電泳采用分離膠濃度為12%，蛋白上樣量40 μg。電泳條件為濃縮膠80 V，分離膠120 V，待溴酚藍(lán)跑出膠后終止電泳。蛋白轉(zhuǎn)膜按照伯樂(lè)半干轉(zhuǎn)膜儀操作說(shuō)明，200 mA, 1h進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉——一抗4 ℃孵育過(guò)夜（人溶菌酶、GAPDH 1∶1 000稀釋）——TBST洗滌（3次，每次10 min）——二抗室溫孵育2 h（1∶3 000稀釋）——TBST洗滌（3次，每次10 min）——顯影——ChemiDoc XRS+儀器成像。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct方法對(duì)real-time qPCR 分析計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。GraphPad Prism 6.0進(jìn)行 One-way ANOVA分析和作圖。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。

2 結(jié)果

2.1 牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子組成分析

通過(guò)CodonW軟件對(duì)牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明，牛乳蛋白基因密碼子 GC含量平均為 0.485 ± 0.026，第三位堿基GC3s含量平均為0.537 ± 0.062。人溶菌酶基因密碼子GC含量為0.473，第三位堿基GC3s含量為0.407。上述結(jié)果表明，人溶菌酶基因整體 GC含量與牛乳蛋白基因GC含量相近，但第三位堿基GC含量低于牛乳蛋白基因 GC含量。牛乳蛋白基因密碼子偏好以 GC結(jié)尾，而人溶菌酶基因密碼子偏好以 AT結(jié)尾（表3）。

ENc值范圍為20（每個(gè)氨基酸只使用一個(gè)密碼子）到61（各個(gè)密碼子被均衡使用），其值越低，偏好性越強(qiáng)。牛乳蛋白及人溶菌酶ENc值分別為49.814和50.27，表明牛乳蛋白和人溶菌酶基因密碼子使用相對(duì)較平均。ENC vs GC3s線性回歸分析結(jié)果表明，7種乳蛋白基因有效密碼子數(shù) ENc值與第三位堿基GC3s呈顯著負(fù)相關(guān)（R= - 0.8968，P＜0.01）（圖1），表明密碼子使用偏好性越強(qiáng)（ENc值越?。┑幕颍銰C3s值越高，主要偏好以GC堿基結(jié)尾的密碼子。因此，牛乳蛋白基因密碼子的使用偏好性受GC3s影響。

2.2 牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性分析

對(duì)編碼氨基酸且為簡(jiǎn)并密碼子的7種牛乳蛋白基因使用的共59個(gè)密碼子（不含Met、Trp及3個(gè)終止密碼子）進(jìn)行同義密碼子的相對(duì)使用度（RSCU）分析。結(jié)果表明，牛乳蛋白基因?qū)TG（2.71）、AGG（2.32）、GCC（1.73）、GTG（1.68）、ATC（1.64）等5個(gè)密碼子具有明顯的偏好性（RSCU＞1.5），為高頻密碼子。而 TTA（0.12）、ATA（0.18）、TCG（0.19）、CTA（0.25）、CCG（0.26）、GCG（0.45）、ACG（0.48）等7個(gè)密碼子在牛乳蛋白基因中使用較?。≧SCU＜0.5），為低頻密碼子（表4）。

表4 牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性分析Table 4 Codon preference analysis of bovine milk protein genes

圖1 牛乳蛋白基因ENc vs GC3s相關(guān)性分析Fig. 1 Correlation analysis of ENc vs GC3s of bovine milk protein genes

2.3 基因密碼子偏好性的聚類分析

以密碼子的RSCU 值作為變量，對(duì)具有簡(jiǎn)并性的59個(gè)編碼氨基酸的密碼子進(jìn)行聚類分析。依據(jù)RSCU值可以將7種牛乳蛋白較好的分成為兩大類：酪蛋白類（CSN2、CSN1S2、CSN3和CSN1S1）和乳清蛋白類（LTF、LGB和 LALBA），而人溶菌酶基因密碼子使用偏好與牛乳酪蛋白類更接近（圖 2）。結(jié)果表明，即使在同一乳腺組織內(nèi)，編碼牛乳酪蛋白類基因密碼子和乳清蛋白類基因密碼子在使用偏好性上可能也存在一定差異。

2.4 人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化及分析

根據(jù)表3結(jié)果中牛乳蛋白基因高頻密碼子及低頻密碼子使用情況，對(duì)人溶菌酶密碼子進(jìn)行了優(yōu)化。其中LYZop對(duì)溶菌酶全局密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，而 LYZop22只對(duì)翻譯起始區(qū)前22位密碼子進(jìn)行了優(yōu)化（表5）。

表5 人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化情況Table 5 Codon Optimization of human lysozyme gene

圖2 牛乳蛋白及人溶菌酶基因密碼子使用RSCU值聚類分析Fig. 2 Clustering analysis of bovine milk protein and human lysozyme genes based on RSCU value

CodonW比較優(yōu)化前后序列，結(jié)果表明，LYZcw、LYZop22、LYZop第三位堿基即 GC3s含量分別為0.407、0.450、0.757。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能MFE從-138.83 kcal/mol（LYZcw）分別降低到了-141.02 kcal/mol（LYZop22）和-178.12 kcal/mol（LYZop），mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性明顯提高。對(duì)mRNA翻譯起始區(qū)100個(gè)堿基進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)相比于LYZcw（-29.7 kcal/mol），LYZop22（-26.4 kcal/mol）和 LYZop（-31.0 kcal/mol）密碼子優(yōu)化并沒(méi)有明顯改變翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能，相反在5′端引入了更多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖3），有利于核糖體與mRNA的結(jié)合并啟動(dòng)翻譯。

圖3 人溶菌酶密碼子優(yōu)化翻譯起始區(qū)（1-100 bp）mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 3 Schematic diagram of RNA second structure of codon optimized human lysozyme gene (1-100bp)

2.5 人溶菌酶-熒光素融合載體構(gòu)建及溶菌酶表達(dá)分析

電泳和測(cè)序結(jié)果表明，成功克隆到了人溶菌酶野生型LYZcw、翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化的LYZop22 CDS區(qū)序列及全基因合成的全局密碼子優(yōu)化的 LYZop CDS區(qū)序列，且與預(yù)期序列信息一致（圖4）。Nco1酶切和測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了 pGL3-LYZcw/op22/op 3個(gè)人溶菌酶-熒光素酶融合表達(dá)載體，且LYZcw、LYZop22、LYZop編碼區(qū)與螢火蟲熒光素酶基因正確融合，沒(méi)有移碼突變（圖5）。

圖4 LYZcw、LYZop22和LYZop電泳檢測(cè)Fig. 4 LYZcw, LYZop22 and LYZop electrophoresis detection

圖5 pGL3-LYZcw/op22/op載體Nco1酶切鑒定Fig. 5 pGL3-LYZcw/op22/op vector identified by Nco1 enzyme digestion

通過(guò)lipo3000 將pGL-LYZcw+pRL-tk、pGL-LYZop+ pRL-tk、pGL-LYZop22 + pRL-tk分別轉(zhuǎn)染BMEC、BFFC、C127細(xì)胞，48 h后檢測(cè)熒光素酶表達(dá)量。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果表明，相比LYZcw，全局密碼子優(yōu)化的LYZop在BMEC和對(duì)照BFFC、C127細(xì)胞中分別提高了2.20倍（P＜0.01）、2.44倍（P＜0.01）和1.99倍（P＜0.01）。翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化的 LYZop22在BMEC細(xì)胞中相比野生型提高了1.48倍（P＜0.01），而在對(duì)照BFFC、C127細(xì)胞中差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

2.6 mRNA、蛋白水平檢測(cè)人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化效果

構(gòu)建 pcDNA-LYZcw/op22/op過(guò)表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)染BMEC、BFFC和C127細(xì)胞，檢測(cè)密碼子優(yōu)化對(duì)人溶菌酶mRNA表達(dá)量的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC細(xì)胞中分別提高了2.08倍（P＜0.05）和1.5倍（P＞0.05）。而LYZop相比野生型LYZcw在上述兩個(gè)細(xì)胞中分別提高了17.8倍（P＜0.01）和22倍（P＜0.01）（圖 7）。上述結(jié)果表明，根據(jù)牛乳腺主要蛋白進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的溶菌酶能顯著提高其在牛乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量。

進(jìn)一步對(duì) pcDNA-LYZcw/op22/op過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的牛BMEC細(xì)胞進(jìn)行人溶菌酶蛋白表達(dá)檢測(cè)。相比野生型LYZcw，密碼子優(yōu)化的LYZop、LYZop22明顯提高了人溶菌酶在牛BMEC細(xì)胞中的表達(dá)量，且全局密碼子優(yōu)化的 LYZop溶菌酶表達(dá)量高于翻譯起始區(qū)密碼子優(yōu)化的LYZop22（圖8-A）。上述結(jié)果表明，密碼子優(yōu)化能明顯提高人溶菌酶在牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)。然而，經(jīng)全局密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因在牛乳腺上皮細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平提高倍數(shù)低于mRNA水平提高倍數(shù)（圖8-B）。

圖6 熒光素酶檢測(cè)人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化效果Fig. 6 The effect of codon optimization analysis of human lysozyme gene by luciferase

圖7 mRNA水平檢測(cè)人溶菌酶基因密碼子優(yōu)化效果Fig. 7 The effect of codon optimization analysis on human mRNA level of human lysozyme gene

3 討論

人溶菌酶作為非特異性免疫因子，對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌等均具有廣譜的抗菌作用，在體內(nèi)發(fā)揮著殺菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、改善胃腸道菌群的作用。同時(shí)，在畜牧、農(nóng)產(chǎn)品、食品、醫(yī)療和化妝品輕工等行業(yè)也具有廣泛應(yīng)用前景。利用現(xiàn)代基因工程和乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人溶菌酶克服了傳統(tǒng)提取方法蛋白穩(wěn)定性差、成本高的不足，但如何進(jìn)一步提高重組蛋白的表達(dá)量并用于下一步工業(yè)化生產(chǎn)仍是乳腺生物反應(yīng)器首要考慮的問(wèn)題。

圖8 蛋白水平檢測(cè)密碼子優(yōu)化對(duì)人溶菌酶表達(dá)量的影響Fig. 8 The effect of codon optimization analysis on protein level of human lysozyme

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，不同生物密碼子的選擇不僅對(duì)蛋白高水平表達(dá)發(fā)揮作用，同時(shí)對(duì)微量的調(diào)控蛋白表達(dá)也起到調(diào)節(jié)作用[13]，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于提高外源重組蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。研究發(fā)現(xiàn)，同一物種，不同組織甚至同一組織內(nèi)不同蛋白其密碼子使用偏好性均存在差異，正是這種差異可能進(jìn)一步調(diào)節(jié)著蛋白的表達(dá)量[18]。本研究中根據(jù)牛乳中7種主要乳蛋白基因密碼子偏好性進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，牛乳中酪蛋白類（CSN2、CSN1S2、CSN3和CSN1S1）和乳清蛋白類（LTF、LGB和 LALBA）可以明顯的分為兩類。表明，同一組織內(nèi)牛乳酪蛋白和乳清蛋白基因密碼子使用偏好存在一定的差異，而這種密碼子使用偏好性可能在一定程度上影響著牛乳酪蛋白和乳清蛋白表達(dá)量。密碼子使用偏好性分析發(fā)現(xiàn)，牛乳蛋白基因中發(fā)現(xiàn)5個(gè)高頻密碼子和7個(gè)低頻密碼子，且牛乳蛋白基因密碼子第三位堿基偏好以GC結(jié)尾，而人溶菌酶偏好以AT結(jié)尾。而較高的GC含量，特別是簡(jiǎn)并堿基GC含量在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中與mRNA豐度和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)[19-20]。表明，人溶菌酶密碼子使用偏好性不利于在牛乳中高效表達(dá)，這也可能是造成牛乳腺生物反應(yīng)器中重組人溶菌酶表達(dá)量低的主要原因[17, 21]。

密碼子使用偏好性在調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性、蛋白翻譯起始、延伸等方面發(fā)揮了重要的作用[22-23]。本研究中局部和全局密碼子優(yōu)化后的人溶菌酶 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能 MFE分別由-138.83 kcal/mol降低到了-141.02 kcal/mol和-178.12 kcal/mol。前人研究發(fā)現(xiàn)，mRNA折疊強(qiáng)度與 mRNA豐度和蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著密碼子優(yōu)化后人溶菌酶mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的增加，其mRNA表達(dá)量也相應(yīng)提高。在牛BMEC等3種細(xì)胞中，全局密碼子優(yōu)化的人溶菌酶 mRNA水平顯著高于局部密碼子優(yōu)化的人溶菌酶，這一結(jié)果也與優(yōu)化后 mRNA 穩(wěn)定性呈正相關(guān)。表明，密碼子優(yōu)化可能通過(guò)增加mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和 mRNA轉(zhuǎn)錄效率進(jìn)而提高了人溶菌酶mRNA表達(dá)水平。

研究發(fā)現(xiàn)，mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)5′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)有利于蛋白翻譯起始和延伸，進(jìn)而提高蛋白表達(dá)量[26-27]。密碼子優(yōu)化后的溶菌酶盡管整體mRNA MFE明顯降低，但進(jìn)一步對(duì) 5′端翻譯起始后 100 bp mRNA堿基進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，密碼子優(yōu)化并沒(méi)有明顯改變?nèi)巳芫富蚯?00bp 二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能，反而在翻譯起始區(qū)引入了更多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而5′端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引入，有利于提高蛋白翻譯起始效率[28]。釀酒酵母中研究發(fā)現(xiàn)，蛋白表達(dá)豐度與 mRNA折疊強(qiáng)度存在正相關(guān)，而有效的 mRNA翻譯起始效率和較高的 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)縮短了核糖體之間的距離，使 mRNA的翻譯效率提高，進(jìn)而提高了蛋白的表達(dá)豐度[25,29]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，翻譯區(qū)密碼子優(yōu)化后牛 BMEC和 BFFC細(xì)胞中人溶菌酶基因mRNA水平和蛋白水平相比野生型都有一定程度的提高。全局密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因，在mRNA翻譯起始區(qū)引入了更多的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)，mRNA整體折疊也更穩(wěn)定。因此，密碼子優(yōu)化后的人溶菌酶表達(dá)量在 mRNA 水平和蛋白水平相比野生型均得到明顯的提高。

密碼子優(yōu)化是提高外源重組蛋白表達(dá)的重要途徑之一。盡管目前已開(kāi)發(fā)許多軟件可根據(jù)宿主密碼子使用偏好對(duì)目的基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化和設(shè)計(jì)，然而關(guān)于密碼子優(yōu)化的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍未統(tǒng)一，密碼子優(yōu)化的效果也不盡如人意，歸根結(jié)底是由于目前關(guān)于密碼子優(yōu)化是如何影響外源蛋白表達(dá)仍存在很大的爭(zhēng)議。密碼子優(yōu)化在mRNA轉(zhuǎn)錄效率[30]、穩(wěn)定性[31]，蛋白翻譯起始[32]、延伸效率、蛋白折疊及蛋白穩(wěn)定性[33]等多個(gè)環(huán)節(jié)均發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。ZHOU等研究發(fā)現(xiàn)，密碼子優(yōu)化提高了目的基因蛋白和RNA表達(dá)水平，但主要是體現(xiàn)在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的提高[30]。PRESNYAK 等[31]認(rèn)為，密碼子優(yōu)化是決定 mRNA穩(wěn)定性的主要因素。本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)全局密碼子優(yōu)化的人溶菌酶基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性得到明顯提高，其在牛乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平提高了17.8倍，然而其蛋白水平提高倍數(shù)卻低于mRNA水平提高倍數(shù)。表明，密碼子優(yōu)化大幅提高了重組人溶菌酶mRNA的表達(dá)水平，但mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平并不一定呈強(qiáng)相關(guān)[34]，而mRNA轉(zhuǎn)錄后的修飾可能進(jìn)一步影響了蛋白的表達(dá)。因此，通過(guò)密碼子優(yōu)化提高mRNA表達(dá)水平的同時(shí)如何進(jìn)一步提高蛋白表達(dá)水平及其內(nèi)在分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析了牛乳腺主要乳蛋白基因密碼子使用偏好，獲得了牛乳蛋白基因密碼子使用偏好及使用的高低頻密碼子；依據(jù)牛乳蛋白基因密碼子使用偏好性對(duì)人溶菌酶全局密碼子優(yōu)化能顯著提高重組人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量，為今后利用生物反應(yīng)器高效生產(chǎn)重組人溶菌酶奠定基礎(chǔ)。