縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A培養(yǎng)條件的優(yōu)化

茍 歡 王 莉 范一婷 賀新生 袁小紅

縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A培養(yǎng)條件的優(yōu)化

茍 歡 王 莉 范一婷 賀新生 袁小紅*

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

為優(yōu)化縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A的固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)條件，采用高效液相色譜法，測(cè)定分析固體培養(yǎng)培養(yǎng)料不同棉籽殼與麥麩比例配方，及液體培養(yǎng)不同碳源、氮源和培養(yǎng)時(shí)間的環(huán)肽Xylastriamide A含量差異。結(jié)果：固體培養(yǎng)，以培養(yǎng)料中的棉籽殼/麥麩比為70/30時(shí)，子實(shí)體的環(huán)肽Xylastriamide A含量較高，達(dá)578.20 μg/g；液體培養(yǎng)，最佳碳源和最佳氮源分別為麥芽糖和酵母浸出粉，培養(yǎng)14天得到的菌絲球環(huán)肽Xylastriamide A含量分別達(dá)到9.77 μg/g和19.95 μg/g。

縱條紋炭角菌；高效液相色譜法；固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)

縱條紋炭角菌（），隸屬于子囊菌亞門(mén)、炭角菌科、炭角菌屬，廣泛分布在廣西、四川、貴州、海南等地區(qū)[1]。本課題組對(duì)縱條紋炭角菌進(jìn)行多年研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗菌[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、改善睡眠[5]等藥理活性。已有學(xué)者對(duì)縱條紋炭角菌子實(shí)體成分及其效應(yīng)進(jìn)行研究[6-10]，雷傳文等[10, 11]采用HPLC半制備方法分離得到新的環(huán)肽Xylastriamide A，并通過(guò)體外藥理活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Xylastriamide A具有顯著的抗腫瘤活性，在濃度為40 μmoL/L時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制率超過(guò)65%，對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)也有一定的抗蟲(chóng)活性，其IC50值為103.54 μg/mL。為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)這類(lèi)新的環(huán)肽Xylastriamide A成分，在前期試驗(yàn)所得的縱條紋炭角菌子實(shí)體最適培養(yǎng)條件[12]和菌絲最適液體培養(yǎng)條件[13]的基礎(chǔ)上，我們通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)條件下環(huán)肽Xylastriamide A的含量，對(duì)其環(huán)肽Xylastriamide A的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

（2）試劑。環(huán)肽Xylastriamide A對(duì)照品（實(shí)驗(yàn)室自制）；乙腈，色譜純（塞默飛世爾科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）固體培養(yǎng)試驗(yàn)。設(shè)9種培養(yǎng)料配方，其棉籽殼/麥麩比分別為100/0，95/5，90/10，85/15，80/20，75/25，70/30，65/35，60/40，加水量為棉籽殼和麥麩總量的1.3倍[14]。按不同比例配方得到的縱條紋炭角菌子實(shí)體分別標(biāo)記為樣品a、b、c、d、e、f、g、h、i。每種配方設(shè)3個(gè)重復(fù)，以防接種后有污染。

取36個(gè)罐頭瓶，將配制好的培養(yǎng)料裝罐，每瓶裝料重50 g，120 ℃高壓滅菌1 h。待罐頭瓶冷卻后，在超凈工作臺(tái)上接種。為便于后期觀察菌絲生長(zhǎng)情況，接種方法為在培養(yǎng)料緊挨瓶壁處挖一個(gè)小孔，接入1 cm2左右的菌種。接種完成后放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)55天。將培養(yǎng)得到的縱條紋炭角菌子實(shí)體從瓶中摘下。記錄每配方子實(shí)體數(shù)量、鮮重，三次測(cè)其長(zhǎng)度取平均值后，置于60 ℃烘干箱內(nèi)干燥24 h，測(cè)得干重，并進(jìn)行檢測(cè)。

（2）液體培養(yǎng)試驗(yàn)。液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：葡萄糖4%，蛋白胨0.4%，硫酸鎂0.15%，磷酸二氫鉀0.3%[13]，pH自然。配制540 mL培養(yǎng)基，均勻分裝至9個(gè)100 mL的錐形瓶中，每瓶裝60 mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基設(shè)3次重復(fù)。碳源試驗(yàn)配方：僅改變液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖為乳糖、蔗糖、麥芽糖。氮源試驗(yàn)配方：僅改變液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源蛋白胨為黃豆餅粉、酵母浸出粉。

采用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，121 MPa下保持30 min。滅菌完畢后取出培養(yǎng)基，放置在超凈工作臺(tái)上，待冷卻至常溫后按無(wú)菌操作進(jìn)行接種。接種步驟：選取生長(zhǎng)良好的試管菌種，點(diǎn)燃酒精燈，將接種環(huán)在酒精燈下灼燒滅菌，冷卻后取1 cm左右的菌種塊接入錐形瓶中。接種完成后，于30 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min下振蕩培養(yǎng)。收集培養(yǎng)13天、14天、15天的菌絲球，將發(fā)酵液過(guò)濾分離，置于60 ℃干燥箱內(nèi)干燥12 h，測(cè)其干重。由于在預(yù)試驗(yàn)中已經(jīng)確定培養(yǎng)液不含環(huán)肽Xylastriamide A，因此直接檢測(cè)菌絲球。

1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

對(duì)環(huán)肽Xylastriamide A對(duì)照品在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外檢測(cè)，結(jié)果在254 nm處有最大吸收峰，故本試驗(yàn)選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.4 色譜條件

1.5 對(duì)照品溶液的制備

精確稱(chēng)取縱條紋炭角菌環(huán)肽，加乙腈溶解配置成3.5 μg/mL、5 μg/mL、7 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL的對(duì)照品。

1.6 供試品溶液的制備

（1）固體培養(yǎng)的供試樣品制備。將固體培養(yǎng)得到的縱條紋炭角菌子實(shí)體制成供試樣品溶液，由于培養(yǎng)料配方不同及有部分培養(yǎng)罐被污染，導(dǎo)致各配方產(chǎn)量不一致。精確稱(chēng)取樣品a為2.00 g、b為2.00 g、c為5.00 g、d為4.10 g、e為5.10 g、f為6.19 g、g為3.04 g、h為4.05 g、i為4.12 g，為使培養(yǎng)得到的子實(shí)體利用最大化，將其置于錐形瓶中，按照1∶10加入乙醇搖勻靜置浸提3 h，過(guò)濾，再將濾渣按上述方法重新浸提2次，共9 h。將濾液倒入旋蒸瓶?jī)?nèi)，50 ℃水浴旋蒸蒸發(fā)乙醇至樣品呈浸膏狀，再按質(zhì)量比1∶4加入水，溶解浸膏。加入相同量的二氯甲烷萃取，重復(fù)3次，得到含環(huán)肽的萃取液[8]。

將萃取液倒至旋蒸瓶中，50 ℃水浴旋蒸蒸發(fā)乙醇至樣品呈浸膏狀，再加1 mL甲醇進(jìn)行溶解，置于離心管中，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，去濾液作為固體供試樣品溶液。

（2）液體培養(yǎng)的供試樣品制備。將液體培養(yǎng)的菌絲球干燥后精確稱(chēng)重，置于錐形瓶中，按照1∶10加入甲醇搖勻靜置浸提3 h，過(guò)濾，再將濾渣按上述方法重新浸提2次，共9 h。由于菌絲球產(chǎn)量遠(yuǎn)少于子實(shí)體，因此未用二氯甲烷萃取除雜，以避免萃取過(guò)程增加環(huán)肽Xylastriamide A的損失。

將濾液旋蒸成浸膏，再直接加甲醇溶解至離心管1 mL處，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，去濾液作為液體供試樣品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體培養(yǎng)的子實(shí)體生長(zhǎng)情況

由表1可知，各配方生物學(xué)效率，以棉籽殼/麥麩比75/25為最高，達(dá)13.73%；90/10、80/20、60/40配方也較高；全部為棉籽殼的配方生物學(xué)效率最低，僅為4.45%。

表1 不同固體培養(yǎng)料配方的子實(shí)體生長(zhǎng)比較

2.2 線性關(guān)系考察

分別取縱條紋炭角菌環(huán)肽對(duì)照品溶液3.5 μg/mL、5 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL各20 μL進(jìn)樣，測(cè)定對(duì)照品溶液吸收峰峰面積（圖1）。以質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)，峰面積（）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程=21.122– 61.954（2=0.9838，n=5）（圖2）。表明縱條紋炭角菌環(huán)肽線性關(guān)系良好。

圖1 環(huán)肽Xylastriamide A對(duì)照品色譜圖

圖2 環(huán)肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 固體培養(yǎng)中不同棉籽殼/麥麩比對(duì)環(huán)肽Xylastriamide A含量的影響

通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定固體培養(yǎng)子實(shí)體的環(huán)肽Xylastriamide A含量（表2），結(jié)果以固體培養(yǎng)料中的棉籽殼/麥麩比為70/30時(shí)，子實(shí)體的環(huán)肽含量較高，達(dá)578.20 μg/g，不同棉籽殼/麥麩比處理的平均環(huán)肽含量為153.19 μg/g。

表2 固體培養(yǎng)的縱條紋炭角菌環(huán)肽XylastriamideA含量

注：a～i表示不同比例配方固體培養(yǎng)得到的子實(shí)體樣品，j表示野生縱條紋炭角菌。

2.4 液體培養(yǎng)中不同碳源、氮源及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)環(huán)肽Xylastriamide A含量的影響

通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定，由峰面積等數(shù)據(jù)得到液體培養(yǎng)菌絲球環(huán)肽Xylastriamide A含量。結(jié)果（表3）表明，液體培養(yǎng)中以酵母粉為氮源培養(yǎng)14天的菌絲球環(huán)肽含量較多，為19.95 μg/g；以麥芽糖為碳源培養(yǎng)14天的菌絲球環(huán)肽含量較多，為9.77 μg/g。檢測(cè)培養(yǎng)15天的酵母浸出粉、葡萄糖培養(yǎng)基的菌絲球環(huán)肽含量為0。這可能是由于環(huán)肽被全部降解所致。所有液體培養(yǎng)基配方處理的環(huán)肽含量均在第14天達(dá)到峰值，之后都有不同程度的降解。

表3 液體培養(yǎng)的縱條紋炭角菌環(huán)肽Xylastriamide A含量

在液體培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基有不同程度的污染，其中以黃豆餅粉為氮源的培養(yǎng)基污染最為嚴(yán)重，原因可能是黃豆餅粉沒(méi)有經(jīng)過(guò)熬制，滅菌不夠徹底等，因此棄用。其他液體培養(yǎng)基也有輕度污染，可能是因接種等環(huán)節(jié)操作不當(dāng)所致。

3 討 論

本研究為提高縱條紋炭角菌中環(huán)肽Xylastriamide A的含量，探索其優(yōu)化培養(yǎng)條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，固體培養(yǎng)不同棉籽殼/麥麩料比例配方的環(huán)肽含量有較大差異，以棉籽殼/麥麩比為70/30時(shí)環(huán)肽含量較高，達(dá)578.20 μg/g。培養(yǎng)料中的麩皮占比對(duì)子實(shí)體環(huán)肽含量的影響較大。液體培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果：最佳氮源為酵母浸出粉，最佳碳源為麥芽糖。各液體培養(yǎng)基配方處理均在第14天達(dá)到峰值，之后都有不同程度的降解，尤其酵母浸出粉和葡萄糖配方處理的菌絲球在第15天時(shí)檢測(cè)不到環(huán)肽。這是否與液體培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)線等有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

與液體培養(yǎng)相比，固體培養(yǎng)所得的子實(shí)體環(huán)肽Xylastriamide A含量更高。其含量高低可能與生長(zhǎng)發(fā)育階段有很大關(guān)系。但液體培養(yǎng)時(shí)間比固體培養(yǎng)時(shí)間短很多，因此更適合用于生產(chǎn)。后期可以加大液體培養(yǎng)，設(shè)計(jì)最佳方案以獲取更多的環(huán)肽Xylastriamide A，為后續(xù)生物活性研究奠定基礎(chǔ)。

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Optimization of culture conditions of cyclopeptide Xylastriamide A in

Gou Huan Wang Li Fan Yiting He Xinsheng Yuan Xiaohong*

（School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science And Technology, Mianyang, Sichuan 621010, China）

The content of cyclopeptide Xylastriamide A inwas increased by optimizing the culture conditions. Determination of cyclopeptide Xylastriamide A inby HPLC. The solid culture materials were optimized, and the content of cyclopeptide Xylastriamide A in different ratios of cottonseed hull and wheat bran of culture medium formulas were compared; and the liquid culture which was based on the basic mediumwas to compare the content of cyclopeptide Xylastriamide A in different carbon sources, nitrogen sources and culture time. The results showed that when the ratio of cottonseed hull to wheat bran was 70∶30 in culture medium formula, the content of cyclopeptide Xylastriamide A in fruiting body was as high as 578.20 μg/g. In liquid culture, The best carbon source and nitrogen source were maltose and yeast powder, the Xylastriamide A content of mycelium after 14 days of culture was 9.77 μg/g and 19.95 μg/g, respectively.

; HPLC; solid culture; liquid culture

S646，R285

B

2095-0934（2020）05-309-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21272189）；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（201810619088）；中國(guó)國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)（2019ZX08010-004）

茍歡（1998—），女，四川南充人，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：1203522826@qq.com。

袁小紅，博士，教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬锖捅＝∈称?。E-mail：419225263@qq.com。