正交試驗優(yōu)選酒炙牛樟芝的炮制工藝

楊義雄，梁 霜，魏文增，周春權(quán)，王 瑾，王 宮

（1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

牛樟芝（Antrodia cinnamomea）為臺灣特有的多孔菌科薄孔菌屬珍貴藥用真菌，又名牛樟菇、樟菇、樟芝、紅樟芝［1-2］。牛樟芝子實體含有大量多糖、三萜和甾醇等［3-6］，具有保肝、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等多種功效［7-10］，市場需求量極大，加之生長緩慢，價格昂貴［11］。牛樟芝性寒味苦［12］，長期服用易損傷脾胃［13］。為緩和其寒性，減輕副作用，增加有效成分溶出度，本研究擬通過傳統(tǒng)的炮制技術(shù)，用酒進(jìn)行炮制，采用正交試驗設(shè)計，以總?cè)?、粗多糖含量為指?biāo)，篩選牛樟芝的最佳酒炙工藝，為牛樟芝的炮制工藝及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 751型紫外-可見分光光度計（上海分析儀器廠）；ACS-DⅡ三峰牌溫控茶葉電砂鍋（杭州富陽區(qū)銀湖街道康泉五金經(jīng)營部）；AR2140 電子天平（上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；RT-04 小型高速粉碎機(jī)（北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司）；DZF-6051 真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200B超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2材料 實驗用牛樟芝子實體（濕）購于漳州帝寶牛樟芝生物科技股份有限公司，經(jīng)鑒定為椴木牛樟芝的子實體。炮制用酒:市售古越龍山陳年五年紹興花雕酒（酒精度≥15.0%）；D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201506）；齊墩果酸（中國食品藥品檢定研究院，批號110709-201607）；水為蒸餾水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1酒炙牛樟芝的制備 將牛樟芝剪碎后60.0 ℃烘干，稱重。根據(jù)酒炙的主要影響因素并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道［14-15］，以黃酒為輔料，采用L9（34）正交試驗法對牛樟芝酒制過程中黃酒用量、炮制溫度和炮制時間進(jìn)行考察（因素水平見表1）。稱取9 份干燥后的椴木牛樟芝，每份5 g，按表2正交試驗方案分別加入不同比例的黃酒（先按比例量取黃酒，再加蒸餾水至10 ml）拌勻，悶潤3 h 至黃酒被吸盡，置于電砂鍋內(nèi)，不同溫度下炒制不同的時間，晾涼冷卻，粉碎成粗粉備用。

表1 正交因素水平表

2.2總?cè)坪康臏y定［16］

2.2.1齊墩果酸對照品溶液的配制 精密稱取一定量齊墩果酸對照品，加甲醇溶解，搖勻，制成濃度為0.132 mg/ml的齊墩果酸對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取按正交試驗方案提取得到的9份酒炙牛樟芝粗粉樣品適量，采用索式提取4 h后，轉(zhuǎn)移提取液至100 ml容量瓶中，定容，備用。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取齊墩果酸對照品溶液0 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml，分別置于具塞試管中，揮干后，加入5%香草醛-冰醋酸0.2 ml、高氯酸0.8 ml，立即搖勻，于70 ℃水浴加熱15 min 后，冰浴冷卻5 min，再加4 ml 乙酸乙酯搖勻。在波長546 nm 處測定吸光度?；貧w方程為Y=50.125X-0.003（r2=0.999 5）。表明齊墩果酸對照品溶液在0～0.016 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4供試品的測定 從“2.2.2項”取一定量供試品溶液于15 ml 具塞試管中，按“2.2.3 項”操作，測定其吸光度。

2.3粗多糖含量的測定［17］

2.3.1D-無水葡萄糖對照品溶液的制備 精密稱取一定量D-無水葡萄糖對照品，加蒸餾水溶解，搖勻，制成濃度為0.157 mg/ml對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的配制 取按正交試驗方案提取得到的9 份酒炙牛樟芝粗粉樣品適量，每份各稱取1.00 g，加適量蒸餾水浸泡0.5 h。提取3 次，每次45 min，合并濾液，濃縮至一定量，加乙醇至濃度為80%，置于冰箱12 h以上，去上清，沉淀復(fù)溶，備用。

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取D-無水葡萄糖對照品溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml，分別置于具塞試管中，補水至2.0 ml，迅速加入0.1%-硫酸蒽酮溶液6 ml，搖勻、放置15 min，冰浴中冷卻15 min。在波長625 nm處測定吸光度?；貧w方程為Y=30.613X+0.006（r2=0.999 4），表明D-無水葡萄糖對照品溶液在0～0.024 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4供試品的測定 從“2.3.2項”分別取一定量供試品溶液于15 ml 具塞試管中，按“2.3.3 項”操作，測定其吸光度。

2.4結(jié)果與分析 正交試驗安排方案與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 L9（34）正交試驗方案設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

從表2結(jié)果可知，各因素影響主次順序為:A（黃酒用量）＞B（炮制時間）＞C（炮制溫度），其中A3＞A2＞A1，B3＞B1＞B2，C3＞C1＞C2。表3 方差分析結(jié)果顯示，因素A、B 對試驗結(jié)果有顯著性影響，C 因素?zé)o明顯差異；因B1與B3相差不大，考慮到黃酒的揮發(fā)性不宜炒制時間長，因此，篩選牛樟芝的最佳酒炙工藝為A3B1C3，即5 g牛樟芝使用的黃酒比例為30%（1.5 g），考慮牛樟芝吸水性強(qiáng)，為使黃酒能均勻濕潤藥材，稱取的黃酒先加蒸餾水至10 ml，再將其均勻噴灑在5 g椴木牛樟芝藥材上。悶3 h至黃酒被吸盡后，置茶葉電砂鍋內(nèi)，150 ℃下炒制10 min，取出。60 ℃烘干至原重量（5 g），粉碎過3 號篩得牛樟芝粉末。

2.5驗證實驗 稱取3 份牛樟芝，每份5 g，分別加入稀釋后的黃酒（1.5 g 黃酒+蒸餾水至10 ml）拌勻，悶潤至黃酒被吸盡，150 ℃下炒制10 min，60 ℃烘干至原重量（5 g），粉碎過3 號篩得牛樟芝粉末。此炮制條件下，測定總?cè)坪痛侄嗵呛糠謩e為6.42%、5.10%，6.28%、5.28%，6.56%、5.33%，平均含量為6.42%、5.24%，高于正交試驗中的最高值。通過驗證實驗結(jié)果可以看出，優(yōu)選的酒炙牛樟芝炮制工藝穩(wěn)定可行。

3 討 論

酒制法是中藥炮制方法中較常用的一種，其輔料分白酒和黃酒。黃酒味甘、辛，性大熱，能升能散、宣行藥勢，具祛風(fēng)散寒、活血通絡(luò)、矯臭去腥等作用。牛樟芝含多糖、三萜、腺苷等多種成分，有防癌抗癌、保肝護(hù)肝等功效。由于腫瘤、肝病等患者本身正氣虛弱，牛樟芝效果雖好，但極其寒涼，不適于長期服用。應(yīng)用中醫(yī)藥炮制理論對牛樟子進(jìn)行酒炙，通過添加黃酒和炒制一定的時間，不僅使牛樟芝活性成分總?cè)坪痛侄嗵堑娜艹雎试黾?，且可改變牛樟芝寒涼之性，減少對胃的刺激。

本研究顯示，黃酒用量和炮制時間兩個因素對炮制結(jié)果有顯著性影響，炮制溫度無明顯差異。黃酒用量對結(jié)果影響最顯著，可增加有效成分的溶出，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報道相類似。本實驗稱取牛樟芝每份5 g，按比例計算的黃酒用量較少，不易拌勻藥物，故先加適量蒸餾水（統(tǒng)一加至10 ml）稀釋，再將其均勻噴灑在5 g椴木牛樟芝藥材上。在預(yù)試驗中，黃酒悶潤時間對有效成分的溶出無顯著性意義，只要保證能將藥材全部悶透即可。悶潤時容器應(yīng)加蓋，以免黃酒揮發(fā)。炒制時應(yīng)炒到近干，顏色加深時取出晾涼。本研究采用90 ℃、120 ℃、150 ℃進(jìn)行炒制，結(jié)果最佳炒制溫度為150 ℃，但因150 ℃溫度較高，容易出現(xiàn)焦斑，影響成品外觀，故翻炒速度要快。

牛樟芝的最佳酒炙工藝為:牛樟芝加30%（g/g）黃酒悶潤3 h，至黃酒被吸盡后于150 ℃炒制10 min，60 ℃烘干，粉碎。驗證實驗表明該工藝穩(wěn)定可行，易于控制，利于牛樟芝總?cè)?、粗多糖的溶出，可為牛樟芝的炮制工藝及質(zhì)量控制提供依據(jù)。