卵胎生許氏平鲉Sox9基因的克隆、啟動(dòng)子分析、表達(dá)及其細(xì)胞定位研究

馬麗曼，張全啟，齊潔，盧夢(mèng)萱，王文基

(1.臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000； 2.中國(guó)海洋大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266003； 3.臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000)

Sox(Sry-related high mobility group box)基因家族是能夠編碼哺乳動(dòng)物雄性決定基因Sry樣HMG box(兩者具有60% 以上氨基酸序列相似性)的一系列基因[1]，之后這些基因在非哺乳動(dòng)物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。研究表明，Sox基因在性腺分化和早期胚胎發(fā)育中具有重要作用，目前，Sox9基因已被許多學(xué)者作為研究脊椎動(dòng)物性別決定與性腺發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵基因。在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類中，Sox9基因在性腺分化中的兩性差異表達(dá)模式表明了Sox9基因在其性別決定和性腺發(fā)育過(guò)程中的重要功能。與哺乳動(dòng)物不同，魚(yú)類的性別決定機(jī)制比較復(fù)雜，如在黃鱔Monopterusalbus[2]、斑馬魚(yú)Daniorerio[3]、青鳉Oryziaslatipes[4-5]、鯉Cyprinuscarpio[6]和黃顙魚(yú)Pelteobagrusfulvidraco[7]等一些硬骨魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)有兩種Sox9基因，且它們?cè)谛韵僦械谋磉_(dá)模式有所不同。而在斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides[8]、尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus[9]、牙鲆Paralichthysolivaceus[10]、金錢(qián)魚(yú)Scatophagusargus[11]和圓斑星蝶Veraspervariegatus[12]中僅發(fā)現(xiàn)了一種Sox9基因，且其兩性差異表達(dá)模式均為精巢強(qiáng)于卵巢。這些研究結(jié)果表明，Sox9基因在魚(yú)類性別決定和性腺發(fā)育中可能發(fā)揮著重要的作用。

許氏平鲉Sebastesschlegeli是中國(guó)北方重要的養(yǎng)殖魚(yú)類，具有個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)、卵胎生、味質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)。目前，許氏平鲉苗種主要來(lái)源于海捕野生苗，人工苗種供給率低，且長(zhǎng)期過(guò)度捕撈對(duì)其資源和遺傳多樣性也會(huì)造成一定程度的破壞。因此，大量人工繁育速生、抗病能力強(qiáng)的許氏平鲉苗種已成為保護(hù)許氏平鲉資源及養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要手段[13]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于許氏平鲉的研究主要集中在人工育苗、胚胎發(fā)育及早期形態(tài)發(fā)育等方面[14-17]。而對(duì)于許氏平鲉性腺發(fā)育及性別決定等分子機(jī)制研究甚少。許氏平鲉是卵胎生魚(yú)類，其繁殖習(xí)性與卵生魚(yú)類有所差異，因此，對(duì)許氏平鲉Sox9性別相關(guān)基因的研究，將有利于豐富魚(yú)類性別決定及性腺發(fā)育的生物學(xué)知識(shí)，也有利于許氏平鲉繁殖和育種工作的開(kāi)展。本研究中，通過(guò)同源克隆、RACE技術(shù)、實(shí)時(shí)定量 PCR、啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析及其細(xì)胞定位等技術(shù)對(duì)許氏平鲉Sox9基因進(jìn)行了分析，旨在為魚(yú)類性別分化和分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用成體許氏平鲉雌、雄魚(yú)各3尾，體長(zhǎng)為(27±2) cm，體質(zhì)量為(758±15)g，購(gòu)自山東省青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng)。不同發(fā)育時(shí)期的仔魚(yú)各5尾,取自煙臺(tái)泰華海珍品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織樣品的制備 成體許氏平鲉取樣當(dāng)天麻醉后立即解剖，取每尾魚(yú)(雌雄魚(yú)各3尾)的肌肉、 肝、全腦、 腎、 鰓、 脾、 腸、 心、 精巢、 卵巢組織，用于成體各組織定量表達(dá)分析。 Omoto 等[18]研究表明，許氏平鲉仔魚(yú)在25日齡時(shí)性腺開(kāi)始分化。本試驗(yàn)中根據(jù)性腺分化的關(guān)鍵時(shí)期(25 日齡) 選取出生后1、 5、 10、 15、 25、 35日齡的仔魚(yú)各5尾，取每尾魚(yú)的軀干部用于仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期定量表達(dá)分析。各樣品用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

用于Sox9基因細(xì)胞定位的材料取自上述成體許氏平鲉的精巢和卵巢，并將其放在1×PBS中漂洗3次，切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的組織塊，放于4% PFA-1×PBS中4 ℃下固定過(guò)夜，固定后保存在100%甲醇中備用。

1.2.2 總RNA和基因組DNA的提取 用Trizol法提取不同發(fā)育時(shí)期仔魚(yú)和成體各組織的總RNA，操作方法根據(jù)Trizol Reagent 使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總RNA樣品經(jīng)DNaseI(TaKaRa)處理后，利用跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)的β-actin引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè) DNA 是否去除干凈。用苯酚-氯仿法從肌肉組織中提取基因組DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)測(cè)定總RNA和基因組DNA的質(zhì)量和數(shù)量。隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV(TaKaRa)對(duì)許氏平鲉成體組織和仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期樣品的總 RNA進(jìn)行cDNA合成。

1.2.3 許氏平鲉Sox9基因克隆 運(yùn)用同源克隆方法，根據(jù)已發(fā)表的魚(yú)類Sox9基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物Sox9-CP-FW/RV(表1)，并以許氏平鲉精巢和卵巢組織的混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性30 s，65 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，以后每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃，共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)(退火溫度從65 ℃降到55 ℃)；隨后95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后再在72 ℃下延伸10 min。

表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in this study

根據(jù)所獲得的核心cDNA片段序列，各設(shè)計(jì)一條特異引物和一條巢式引物用于5′RACE和3′RACE(表1)。用BD SMARTTMRACE cDNA Amplification kit (Clonetech) 進(jìn)行RACE反應(yīng)，具體步驟可參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。根據(jù)許氏平鲉Sox9 基因全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)跨越5′UTR和3′UTR的一對(duì)特異引物Sox9-gn-FW/RV用于內(nèi)含子序列擴(kuò)增(表1)。以許氏平鲉肌肉組織DNA為模板， 運(yùn)用LA Taq酶(TaKaRa)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件同“1.2.3”節(jié)，只是中間兩次延伸溫度由72 ℃變?yōu)?8 ℃，其他條件和程序不變。

利用已克隆得到的許氏平鲉Sox9基因全長(zhǎng)，在靠近基因的5′側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)3個(gè)反向嵌套特異引物SP1、SP2、SP3 用于Sox9基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增。并運(yùn)用染色體步移試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行3次巢式PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件具體參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。以上反應(yīng)所得的PCR產(chǎn)物，均用15 g/L 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并根據(jù)目的條帶大小，用DNA凝膠回收試劑盒(Zymo Research, Irvine CA, USA) 對(duì)目的DNA進(jìn)行回收純化。將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T (TaKaRa)載體上，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans5α (TransGenBiotech) 感受態(tài)細(xì)胞中，采用載體特異引物M13-47/48進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性檢測(cè)， 挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.4 許氏平鲉Sox9 cDNA序列及啟動(dòng)子序列分析 利用NCBI Blast工具(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast)，將得到的核心片段與GenBank中已有的核酸序列進(jìn)行相似性分析，進(jìn)一步確定所得的Sox9基因。運(yùn)用DNASTAR Lasergene及DNAMAN 7.0軟件分析Sox9基因cDNA序列，預(yù)測(cè)ORF。通過(guò)比對(duì)Sox9 DNA與cDNA序列，并結(jié)合其他硬骨魚(yú)類內(nèi)含子情況，確定許氏平鲉Sox9基因的內(nèi)含子位置及數(shù)目。同時(shí)采用ClustalX 1.81軟件比對(duì)不同物種間Sox9蛋白的氨基酸序列。運(yùn)用MEGA 5.0 軟件，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件NNPP(Neural Network Promoter Prediction, http://www. fruitfly.org/seq_ tools/promoter.html)對(duì)所獲得的Sox9基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，確定基因的轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)(TSS)。并利用TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH. html)、Alibaba 2.1 program(http://www.generegulation.com/pub/programs/alibaba2/index. html)、Match Program(http://www. gene-regulation.com/pub/programs.html#match)、TESS(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess)等軟件對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR) 取許氏平鲉成體各組織和仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期樣品各1 μg RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μL cDNA (10 ng/μL)產(chǎn)物進(jìn)行qPCR反應(yīng)。根據(jù)全長(zhǎng)Sox9 cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物Sox9-RT-FW/RV(表1)，并選用本實(shí)驗(yàn)室篩選出的比較穩(wěn)定的Rpl17為內(nèi)參基因[19]。qPCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系(20 μL)包括：cDNA模板(10 ng) 1 μL， 2×SYBR?Premix Ex TaqTM II (TaKaRa) 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL， ROX Reference Dye II 0.4 μL，無(wú)菌水7.8 μL。qPCR反應(yīng)程序(兩步法)為：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火/延伸45 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，并運(yùn)行熔解曲線確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每一試驗(yàn)樣品重復(fù)擴(kuò)增3次?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCT方法計(jì)算[21]。

1.2.6 許氏平鲉Sox9基因在性腺組織中的細(xì)胞定位分析 采用原位雜交方法檢測(cè)許氏平鲉Sox9基因在成體性腺組織中的細(xì)胞定位情況。避開(kāi)Sox9基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物Sox9-SP6-FW/Sox9-T7-RV(表1)，并以含有目的基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并使用凝膠回收試劑盒ZymocleanTM回收目的片段作為合成探針用的模板。探針的體外轉(zhuǎn)錄采用T7/SP6 RNA Polymerase(TaKaRa)試劑盒，詳細(xì)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。合成的探針用NucAway Spin Columns進(jìn)行純化。經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取保存于甲醇中的性腺組織塊，用無(wú)水乙醇充分脫水，二甲苯梯度透明，并置于55 ℃蠟浴中透蠟。將經(jīng)過(guò)透蠟的組織進(jìn)行蠟塊包埋，用切片機(jī)制成厚度為7 μm的切片。將切片用乙醇梯度復(fù)水，蛋白酶K處理。用1×PBST洗去消化液，用4% PFA-1×PBS固定30 min，再用1×PBST浸洗3次。將切片置于60 ℃雜交爐中預(yù)雜交3 h，然后加入Sox9 RNA探針于60 ℃雜交爐中雜交過(guò)夜。雜交后第2天移走RNA探針雜交液，并用SSCT梯度清洗切片，加入按1∶2000比例稀釋的anti-Dig-AP抗體，4 ℃下孵育12～16 h。雜交后第3天用1×PBST洗去多余抗體，加入NBT-BCIP顯色液避光顯色。每隔10 min 觀測(cè)顯色情況。染色結(jié)束后，用1×PBST洗凈染液，用1%中性紅復(fù)染。使用顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-U)觀察并記錄結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 許氏平鲉Sox9基因序列分析

利用DNASTAR軟件將同源克隆得到的核心片段與RACE技術(shù)獲得的兩端側(cè)翼序列進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA拼接，得到了許氏平鲉Sox9完整的cDNA序列(GenBank：KJ624404)。從圖1可見(jiàn)：許氏平鲉Sox9 cDNA全長(zhǎng)2039 bp，包括5′非翻譯區(qū)(5′UTR)336 bp， 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)242 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)1461 bp；在3′UTR中含有多聚腺苷酸加尾信號(hào)(aataaa)和PolyA尾。經(jīng)分析，許氏平鲉Sox9基因的ORF可編碼486個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為53 090。通過(guò)Sox9全長(zhǎng)cDNA序列與其對(duì)應(yīng)基因組DNA序列比對(duì)分析可知，許氏平鲉Sox9基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子大小分別為503 bp和265 bp，且內(nèi)含子和外顯子的邊界都符合“GT-AG”原則。

2.2 氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)與人類Homosapiens、小鼠Musmusculus、非洲爪蟾Xenopuslaevis及其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白序列比對(duì)，可以看出在許氏平鲉Sox9蛋白第107～178氨基酸位置有一個(gè)高度保守的HMG結(jié)構(gòu)域(圖2)。在該HMG盒內(nèi)存在一個(gè)特征性基序AQAARRKL，兩個(gè)核定位信號(hào)NLS1(KRPMNAFMVWAQAARRK)和NLS2(RRRK)，同時(shí)還含有一個(gè)富含亮氨酸的核輸出信號(hào)NES(LSKTLGKLWRLL)。進(jìn)一步分析顯示，許氏平鲉Sox9氨基酸序列與哺乳動(dòng)物Sox9氨基酸序列的相似性較低，其中與人類的一致性為78.0%，與小鼠的一致性為78.2%，與硬骨魚(yú)類斑馬魚(yú)的Sox9b一致性最低，為73.2%，與其他硬骨魚(yú)類的Sox9氨基酸序列則具有較高的相似性，其中與牙鲆和斜帶石斑魚(yú)的一致性最高，分別為 93.9% 和94.1%。

根據(jù)已發(fā)表的各個(gè)物種的Sox9氨基酸序列構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，哺乳類(如人類，小鼠)、鳥(niǎo)類(如雞)和兩棲類(如非洲爪蟾)的Sox9蛋白聚在一起，硬骨魚(yú)類的斑馬魚(yú)Sox9b則分出了較獨(dú)立的一支，而許氏平鲉、三棘刺魚(yú)等其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白聚為一支(圖3)。

2.3 Sox9基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

從圖4-A可見(jiàn)：用染色體步移法得到了許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子序列(GenBank：KJ624401)，長(zhǎng)度為2252 bp。運(yùn)用NNPP軟件對(duì)5′UTR序列及染色體步移得到的序列進(jìn)行分析，確定了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游未檢測(cè)到典型的TATA box及GC box。

從圖4-B可見(jiàn)：利用TFSEARCH、Match Program、Alibaba 2.1和TESS等在線生物學(xué)軟件對(duì)Sox9基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在得到的Sox9基因啟動(dòng)子中，存在特化蛋白Sp1、轉(zhuǎn)錄激活蛋白AP-1、八聚體結(jié)合蛋白Oct-1、叉頭框蛋白FOXD3、肝核因子HNF3β、雌激素受體ER、環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白CREB、 GATA-2、GATA-3、VBP和核因子NF-κB等蛋白結(jié)合位點(diǎn)。此外，在Sox9基因啟動(dòng)子中還預(yù)測(cè)到了性別相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SRY、Sox5和Sox9結(jié)合位點(diǎn)。

2.4 Sox9基因在仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期及成魚(yú)組織的表達(dá)

從圖5-A可見(jiàn)：許氏平鲉Sox9 mRNA在仔魚(yú)發(fā)育階段(出生后1、5、10、15、25、35日齡)均有不同程度的表達(dá)；在出生后5日齡和10日齡時(shí)表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，15日齡和25日齡時(shí)表達(dá)量逐漸上升，隨后在35日齡時(shí)表達(dá)量又有所下降。

從圖5-B可見(jiàn)：許氏平鲉Sox9基因在成體肝、心、腦、腎、脾、鰓、肌肉、腸、精巢、卵巢等組織中均有不同程度的表達(dá)，在腦、鰓和精巢組織中表達(dá)量較高，且顯著高于其他組織(P<0.05)，在肌肉、心、腎和脾中表達(dá)量較低;許氏平鲉Sox9基因在成魚(yú)性腺中表現(xiàn)出性別兩相性差異，即在精巢中的表達(dá)水平要顯著高于卵巢(P<0.05)。

2.5 Sox9基因在成魚(yú)性腺中的細(xì)胞定位分析

采用組織切片原位雜交技術(shù)觀察許氏平鲉Sox9基因在成魚(yú)性腺細(xì)胞中的定位表達(dá)情況。圖6-A和圖6-D是性腺組織切片的H.E染色，可以看出,此階段性腺發(fā)育各時(shí)期細(xì)胞比較完全，適用于細(xì)胞定位分析。原位雜交結(jié)果顯示：許氏平鲉Sox9基因在精巢的生殖細(xì)胞(精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精細(xì)胞)和Sertoli細(xì)胞中均有表達(dá)(圖6-C),且在生殖細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)于Sertoli細(xì)胞；在卵巢的卵母細(xì)胞中同樣檢測(cè)到了Sox9基因轉(zhuǎn)錄本，且在早期發(fā)育的卵母細(xì)胞中表達(dá)信號(hào)較強(qiáng)，同時(shí)Sox9基因在卵巢濾泡細(xì)胞中有微弱表達(dá)(圖6-F)。

3 討論

3.1 Sox9基因的保守性

本研究中從許氏平鲉性腺中克隆得到了Sox9基因全長(zhǎng)cDNA及基因組DNA序列。Sox9 mRNA全長(zhǎng)2039 bp，編碼486個(gè)氨基酸，在107～178氨基酸位置有一個(gè)保守的 HMG 盒。該HMG 盒與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中大多數(shù)物種Sox9氨基酸序列是一致的，均含有一個(gè)特征性基序AQAARRKL，兩個(gè)獨(dú)立的核定位信號(hào)NLS1和NLS2，以及一段富含亮氨酸的核輸出信號(hào)NES。許氏平鲉Sox9基因DNA序列包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，這與哺乳類、鳥(niǎo)類、兩棲類及其他硬骨魚(yú)類的Sox9基因結(jié)構(gòu)相似。分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，許氏平鲉Sox9與其他硬骨魚(yú)類的Sox9蛋白聚在一起，這說(shuō)明Sox9蛋白結(jié)構(gòu)在魚(yú)類中比較保守。

3.2 許氏平鲉Sox9基因的命名

Sox9基因在不同的物種中存在不同數(shù)目的亞型，在人類、小鼠和雞等高等脊椎動(dòng)物中僅找到了一種，而在硬骨魚(yú)如斑馬魚(yú)、青鳉等低等脊椎動(dòng)物中則找到了兩種Sox9基因，命名為Sox9a或Sox9b[3-5]。Volff[20]指出，在硬骨魚(yú)類中存在兩種類型的Sox9基因，也許是由魚(yú)類特有的基因組復(fù)制導(dǎo)致的。目前，Sox9基因亞型的命名無(wú)公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，a或b僅用于區(qū)分同一物種內(nèi)的不同亞型，而無(wú)法用于鑒定真正的直系同源基因，因此，系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果往往比較混亂。本研究中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，許氏平鲉Sox9與三棘刺魚(yú)、石斑魚(yú)、牙鲆的Sox9和半滑舌鰨Sox9a在一簇上，同一簇上出現(xiàn)不同的分型，使得進(jìn)化樹(shù)看起來(lái)比較混亂。這與尼羅羅非魚(yú)[8]、斜帶石斑魚(yú)[9]、牙鲆[10]、金錢(qián)魚(yú)[11]和圓斑星蝶[12]情況相似，本研究在許氏平鲉中目前只發(fā)現(xiàn)了一種Sox9基因，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，與三棘刺魚(yú)Sox9b聚為一支，考慮到在許氏平鲉中有可能存在另外一種亞型，而此亞型的出現(xiàn)可能導(dǎo)致進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建時(shí)聚類發(fā)生改變，所以暫時(shí)命名為Sox9基因。

3.3 許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子分析

對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和功能的研究是基因調(diào)控機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。目前，魚(yú)類性別決定和分化相關(guān)的基因調(diào)控機(jī)制尚不明確。研究Sox9性別相關(guān)基因的啟動(dòng)子將有助于本試驗(yàn)中更好地理解相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在性腺發(fā)育中的作用機(jī)制。通過(guò)染色體步移法得到許氏平鲉Sox9基因啟動(dòng)子序列，綜合多個(gè)生物信息學(xué)軟件最終確定了多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。其中，與已發(fā)表的許氏平鲉Sox3基因啟動(dòng)子[21]有共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如AP-1、GATA-3、Oct-1、FOXD3及性別相關(guān)蛋白SRY、Sox5、Sox9等結(jié)合位點(diǎn)。這些轉(zhuǎn)錄因子有可能共同調(diào)控著Sox3和Sox9基因的表達(dá)，從而影響性腺的發(fā)育。在人類中，SRY基因與Sox9、Sox3基因共同作用決定睪丸的形成[22]。 Kanai等[23]發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物SRY性別決定基因能夠直接調(diào)控Sox9基因的表達(dá)。比較有趣的是，本試驗(yàn)中不僅在許氏平鲉Sox3啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)到了Sox9蛋白結(jié)合位點(diǎn)[21]，而且發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)合位點(diǎn)也存在于許氏平鲉Sox9基因自身啟動(dòng)子中。預(yù)測(cè)結(jié)果提示，Sox9基因在性別調(diào)控機(jī)制中也許作為Sox3基因的上游基因，對(duì)Sox3基因表達(dá)起調(diào)控作用的同時(shí)，對(duì)自身也有一定的反饋調(diào)節(jié)作用。

另外，在許氏平鲉Sox9基因啟動(dòng)子區(qū)還預(yù)測(cè)到了Sp1、CREB、NF-kB、ER等結(jié)合位點(diǎn)。有研究報(bào)道，人類Sox9基因近端啟動(dòng)子受Sp1和CREB結(jié)合蛋白的調(diào)控[24]。核因子NF-kB廣泛存在于各種細(xì)胞，在免疫應(yīng)答、炎癥、細(xì)胞增殖、分化及凋亡等許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。Ushita等[25]發(fā)現(xiàn)，NF-kB能夠強(qiáng)烈激活Sox9基因啟動(dòng)子。雌激素只有與雌激素受體ER結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Cheng等[26]發(fā)現(xiàn)，小鼠ERβ能夠調(diào)控雄激素受體和排卵相關(guān)因子的表達(dá)。Lassiter等[27]發(fā)現(xiàn)，ER在硬骨魚(yú)早期胚胎發(fā)育和性腺分化中起重要作用。因此，本試驗(yàn)中推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子也許能夠直接作用于許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子，從而影響性腺的發(fā)育。本研究中完成的許氏平鲉Sox9基因的啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果，為今后進(jìn)一步研究Sox9基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

3.4 Sox9基因的表達(dá)

組織學(xué)觀察顯示，許氏平鲉在出生后大約25日齡(全長(zhǎng)約20 mm)左右性腺開(kāi)始分化[18]。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示，許氏平鲉Sox9基因在仔魚(yú)發(fā)育時(shí)期各階段均有不同程度的表達(dá)，在出生后5日齡和10日齡時(shí)表達(dá)量有降低趨勢(shì)，15日齡和25日齡(性腺分化關(guān)鍵時(shí)期)時(shí)表達(dá)量逐漸上升。這與圓斑星鰈的表達(dá)模式相似，即圓斑星鰈Sox9基因在仔魚(yú)20～50日齡時(shí)表達(dá)量逐漸下降，在60日齡 (性腺分化時(shí)期) 時(shí)表達(dá)量上升[12]。因此，本試驗(yàn)中推測(cè)許氏平鲉Sox9基因在出生后25日齡(性腺分化時(shí)期)時(shí)的表達(dá)量達(dá)到較高的水平可能與仔魚(yú)性腺分化有關(guān)。

目前，有關(guān)Sox9基因在各脊椎動(dòng)物中的組織差異表達(dá)模式已有研究報(bào)道。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，Sox9基因與雄性性別的決定和性腺發(fā)育相關(guān)，有可能是SRY基因最靠近的下游基因[24]。在硬骨魚(yú)中，Sox9不同類型的基因在性腺中的表達(dá)模式有所不同，如斑馬魚(yú)有Sox9a和Sox9b兩個(gè)Sox9基因，Sox9a在腦、精巢等多種組織中表達(dá)，在卵巢中不表達(dá)，而Sox9b僅在卵巢中表達(dá)[3]。 Zhou等[2]在黃鱔中克隆得到Sox9a1和Sox9a2兩個(gè)Sox9a基因，它們?cè)诰病⒙殉埠烷g性性腺(精卵巢)中均有表達(dá)。在青鳉中先后發(fā)現(xiàn)了Sox9a基因(只在卵巢中表達(dá))和Sox9a2基因(精巢中表達(dá))[4-5]。俞菊華等[7]在黃顙魚(yú)中克隆得到了Sox9a1和Sox9a2兩個(gè)基因，Sox9a1基因在腦、精巢和卵巢中均有表達(dá)，Sox9a2基因只在卵巢中表達(dá)，Sox9a2可能參與了雌性性別決定和卵巢發(fā)育過(guò)程。另外，在尼羅羅非魚(yú)[9]、斜帶石斑魚(yú)[8]、牙鲆[10]和金錢(qián)魚(yú)[11]中目前僅找到一種Sox9基因，且主要在精巢中顯著表達(dá)。以上研究結(jié)果表明，不同類型Sox9基因在魚(yú)類中并未呈現(xiàn)出統(tǒng)一的性別差異表達(dá)模式。但通過(guò)已報(bào)道的研究可知，斑馬魚(yú)Sox9a、青鳉Sox9a2，以及斜帶石斑魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)、牙鲆和金錢(qián)魚(yú)的Sox9基因的表達(dá)模式與哺乳類Sox9基因還是一致的，均在精巢中有較高水平的表達(dá)，表明Sox9基因可能參與了精巢的分化和發(fā)育過(guò)程。本研究中在許氏平鲉中克隆得到了一種Sox9基因，該基因在精巢中的表達(dá)顯著高于卵巢，表現(xiàn)了性別兩相性差異，這與對(duì)尼羅羅非魚(yú)、斜帶石斑魚(yú)、牙鲆、金錢(qián)魚(yú)和圓斑星鰈等Sox9基因的研究結(jié)果是一致的。另外，在許氏平鲉的腦和鰓組織中檢測(cè)到了較高水平的Sox9轉(zhuǎn)錄本，這種現(xiàn)象在其他硬骨魚(yú)中也有報(bào)道，如金錢(qián)魚(yú)[11]和圓斑星鰈[12]。有關(guān)許氏平鲉Sox9基因是否在腦或鰓發(fā)育中起重要作用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前，Sox9基因在其他硬骨魚(yú)中的細(xì)胞定位研究已有相關(guān)報(bào)道。尼羅羅非魚(yú)Sox9基因在未分化性腺的生殖細(xì)胞周圍細(xì)胞中表達(dá)，而性腺分化后僅在精巢的生殖細(xì)胞周圍細(xì)胞中表達(dá)[9]。斜帶石斑魚(yú)Sox9基因僅存在于精巢的Sertoli中[8]。斑馬魚(yú)Sox9a基因在精巢組織的Sertoli細(xì)胞中表達(dá)，而Sox9b基因則在卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)[3]。Yokoi等[4]發(fā)現(xiàn)，青鳉Sox9基因僅在卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)。隨后Nakamoto等[5]在青鳉中得到了精巢型Sox9a2基因，該基因定位于精巢的精原細(xì)胞周圍體細(xì)胞中，而在卵巢中不存在。在許氏平鲉中，本試驗(yàn)中只發(fā)現(xiàn)一種Sox9基因，原位雜交結(jié)果分析顯示，許氏平鲉Sox9基因和其他硬骨魚(yú)類的細(xì)胞定位表達(dá)模式不同， 許氏平鲉Sox9基因綜合了斑馬魚(yú)和青鳉兩種硬骨魚(yú)Sox9基因的細(xì)胞定位表達(dá)模式，即許氏平鲉Sox9基因在精巢的生殖細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞，以及在卵巢的卵母細(xì)胞和濾泡中均有表達(dá)。結(jié)合已有研究可以看出，Sox9在不同硬骨魚(yú)類中對(duì)性腺發(fā)育的貢獻(xiàn)有所不同，許氏平鲉Sox9基因可能在兩性性腺的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。