抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用

楊莉娟 陳楚濤 張學(xué)培 馬劍達(dá) 李紅瑰 鄭東輝 戴冽

【關(guān)鍵詞】抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體;類風(fēng)濕因子;抗環(huán)瓜氨酸肽抗體;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見的慢性炎癥性自身免疫性疾病，以滑膜炎和受累關(guān)節(jié)進(jìn)行性、不可逆性破壞為特征，目前臨床尚不能根治，因此早期診斷與早期治療對避免RA患者病情加重、出現(xiàn)不可逆的關(guān)節(jié)損害尤為重要[1]。血清自身抗體是診斷RA的重要實驗室指標(biāo)。從最早的RF到目前臨床廣泛使用的抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體都是納入RA診斷標(biāo)準(zhǔn)的自身抗體，對RA的診斷有重要價值[2]。然而，目前即使通過聯(lián)合檢測RF和抗CCP抗體提高RA診斷的靈敏度，仍有10%～20%的RA患者血清中檢測不到相應(yīng)的自身抗體，導(dǎo)致這部分血清陰性的RA患者可能被漏診[3]。因此尋找新的RA相關(guān)甚至特異的自身抗體是目前風(fēng)濕性疾病領(lǐng)域?qū)嶒炇以\斷的研究熱點。有研究顯示，瓜氨酸化波形蛋白為抗Sa抗體的靶抗原，抗突變型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗體屬于抗環(huán)瓜氨酸抗體譜的成員之一，是一種較新的診斷RA靈敏度與特異度均較高的血清學(xué)指標(biāo)[4-5]。本研究擬利用前瞻性隊列中RA患者的基線血清，探討抗MCV抗體在RA診斷中的應(yīng)用。

對象與方法

一、研究對象

前瞻性隊列為2014年11月至2018年7月就診于中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院門診及住院的RA患者，診斷符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)或2010年ACR與歐洲風(fēng)濕病學(xué)會（EULAR）聯(lián)合修訂的早期RA分類標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。排除合并其他風(fēng)濕性疾?。ㄈ鏢LE、系統(tǒng)性硬化病、皮肌炎等）、合并嚴(yán)重感染、器官功能衰竭或惡性腫瘤的患者以及不愿意配合的患者。本研究獲得中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與本研究的受試者均簽署知情同意書。

二、臨床資料收集

收集所有患者基線的臨床資料，包括年齡、性別、病程、疼痛視覺模擬評分（VAS，0～10cm）、28個壓痛關(guān)節(jié)數(shù)（28TJC）、28個腫脹關(guān)節(jié)數(shù)（28SJC）、患者總體病情活動度評估（PtGA，0～10cm）、醫(yī)生總體病情活動度評估（PrGA，0～10cm）、ESR（魏氏法，女性0～20mm/h，男性0～15mm/h）、CRP（散射比濁法，0～5mg/L）等，并計算病情活動度，包括28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分（DAS28-CRP）、簡化的疾病活動指數(shù)（SDAI）和臨床疾病活動指數(shù)（CDAI）。根據(jù)DAS28-CRP，將RA病情活動度分為4個等級：DAS28-CRP<2.6為緩解期，DAS28-CRP2.6～3.1為低度活動期，DAS28-CRP3.2～5.1為中度活動期，DAS28-CRP>5.1為高度活動期。

三、RF、抗CCP抗體和抗MCV抗體的檢測及分組

在收集所有患者臨床資料的同時采集其外周靜脈血5ml，分離血清、凍存。自身抗體的檢測：RF采用散射比濁法檢測（德國西門子公司），正常值范圍為0～20U/ml?？笴CP抗體采用ELISA檢測（德國AESKU公司），正常值范圍為0～18RU/ml，檢測濃度上限為300RU/ml。抗MCV抗體采用ELISA定量檢測（德國ORGENTEC公司），正常值范圍為0～20U/ml，檢測濃度上限為1000U/ml。

根據(jù)2010年早期RA分類標(biāo)準(zhǔn)中的血清學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，抗體水平升高但不超過3倍正常上限定義為抗體低滴度陽性，若超過3倍正常上限定義為抗體高滴度陽性[7]。因此，RF20～60U/ml定義為RF低滴度陽性，RF>60U/ml定義為RF高滴度陽性;抗CCP抗體18～54RU/ml定義為抗CCP抗體低滴度陽性，抗CCP抗體>54RU/ml定義為抗CCP抗體高滴度陽性。同時，我們將抗MCV抗體20～60U/ml定義為抗MCV抗體低滴度陽性，抗MCV抗體>60U/ml定義為抗MCV抗體高滴度陽性。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。服從正態(tài)分布的連續(xù)變量以表示。不服從正態(tài)分布的連續(xù)變量以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示。分類變量以例（%）表示，不同抗體陽性率的比較采用配對χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、RA患者的一般特征

共納入148例RA患者，其中116例（78.4%）為女性，年齡為（46.3±12.5）歲，病程為48（12，96）月，26例（17.6%）為DAS28-CRP緩解期，122例（82.4%）為DAS28-CRP活動期，其中20例（13.5%）為輕度活動、72例（48.6%）為中度活動、30例（20.3%）為高度活動，見表1。

二、RA患者自身抗體陽性的分布及陽性率的比較

148例RA患者RF、抗CCP抗體和抗MCV抗體陽性的分布情況見表2，不同的RA患者3種自身抗體的陽性分布不完全一致。RF陽性率為72.3%（107/148），抗CCP抗體陽性率為74.3%（110/148），抗MCV抗體陽性率為77.7%（115/148），3組不同自身抗體陽性率組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（RF與抗CCP抗體陽性率比較χ2=0.129，P=0.720;RF與抗MCV抗體陽性率比較χ2=1.633，P=0.200;抗CCP抗體與抗MCV抗體陽性率比較χ2=0.516，P=0.473）。

三、抗MCV抗體對1987年RA分類標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充價值

148例RA患者中，RF陰性的患者41例。在41例RF陰性的RA患者中，抗CCP抗體的陽性率為41.5%（17/41），抗MCV抗體的陽性率為46.3%（19/41），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.791）。在RF陰性且再次檢測抗CCP抗體仍為陰性的血清學(xué)陰性的24例RA患者中，抗MCV抗體的陽性率為33.3%（8/24），見圖1。

四、RA患者自身抗體滴度的比較

148例RA患者中，RF、抗CCP抗體和抗MCV抗體的低滴度陽性率分別為19.6%（29/148）、19.6%（29/148）和12.2%（18/148）。3組不同自身抗體低滴度陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（RF與抗CCP抗體低滴度陽性率比較χ2=0.000，P=1.000;RF與抗MCV抗體低滴度陽性率比較χ2=2.564，P=0.108;抗CCP抗體與抗MCV抗體低滴度陽性率比較χ2=2.951，P=0.117）。RF、抗CCP抗體和抗MCV抗體的高滴度陽性率分別為52.7%（78/148）、54.7%（81/148）和65.5%（97/148），其中抗MCV抗體的高滴度陽性率高于RF高滴度陽性率（χ2=6.811，P=0.013）和抗CCP抗體的高滴度陽性率（χ2=4.923，P=0.036），見圖2。

五、抗MCV抗體對2010年早期RA分類標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充價值

24例RF和抗CCP抗體均陰性的血清學(xué)陰性RA患者中，抗MCV抗體低滴度陽性和高滴度陽性的患者分別占8.3%（2/24）和25.0%（6/24）。22例RF或抗CCP抗體至少1個低滴度陽性且均無高滴度陽性的患者中，抗MCV抗體低滴度陽性和高滴度陽性的患者分別占9.1%（2/22）和59.1%（13/22），見圖3。

討論

RA是以外周關(guān)節(jié)受累為主的慢性自身免疫性疾病，發(fā)病2年即可造成關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，因此對RA進(jìn)行早期診斷并采取有效治療措施對延緩疾病進(jìn)展、改善預(yù)后具有重要意義。目前診斷RA主要依靠臨床表現(xiàn)、血清學(xué)指標(biāo)及X線。然而，RA患者關(guān)節(jié)出現(xiàn)X線改變往往需要幾個月甚至更長時間，關(guān)節(jié)軟骨通常已達(dá)到不可逆損害，而在RA早期甚至在出現(xiàn)臨床癥狀前血清學(xué)即可檢出RA特征性或相關(guān)性的自身抗體，且血清學(xué)檢測經(jīng)濟(jì)方便，因此血清學(xué)指標(biāo)的檢測對RA的早期診斷具有重要意義[2，8]。

波形蛋白是一種主要在中胚層起源的細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，其在凋亡的巨噬細(xì)胞內(nèi)由肽酰精氨酸脫亞氨酶的作用下發(fā)生瓜氨酸化，這個過程改變了蛋白結(jié)構(gòu)并增加了其潛在的抗原決定簇瓜氨酸。波形蛋白在凋亡細(xì)胞內(nèi)分解后成為核周聚集物，若不能及時清除而持續(xù)存在，則啟動自身免疫應(yīng)答，促使抗MCV抗體的生成。突變型的波形蛋白有額外精氨酸殘基插入，增加了被瓜氨酸化的潛在位點。目前已發(fā)現(xiàn)有多達(dá)45個可被瓜氨酸化的位點，可以更有效地與其特異性抗體結(jié)合，提高了檢測的靈敏度和特異度，因此抗MCV抗體逐漸成為一種新興的輔助診斷RA的血清學(xué)指標(biāo)[5，9-10]。

RF是最早用于診斷RA的自身抗體，RF陽性是1987年ACR修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)中的重要診斷指標(biāo)之一，然而約25%的RA患者血清RF陰性。本研究中有27.7%的RA患者RF陰性，與既往研究相似[4，6]。RF因在其他自身免疫性疾?。ㄈ鏢LE、干燥綜合征等）、腫瘤、結(jié)核病甚至正常的老年人群中也會出現(xiàn)陽性，對RA診斷的特異度較差，限制了其在臨床診斷中的價值，臨床需要不斷開發(fā)新的特異度更高的診斷RA的自身抗體[11]。

抗CCP抗體是存在于RA患者血清中的另一類自身抗體，在RA診斷中具有與RF相似的靈敏度，但特異度更高[12]?？笴CP抗體最早可以在RA患者出現(xiàn)臨床癥狀前14年的血清中出現(xiàn)陽性，平均在RA患者出現(xiàn)臨床癥狀前4.5（0.1～13.8）年可檢測到陽性，因此是RA早期診斷理想的檢測指標(biāo)[13]。1987年ACR分類標(biāo)準(zhǔn)主要適用于長病程的RA患者，對早期RA患者的診斷有明顯的局限性。2010年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)將抗CCP抗體和RF共同作為RA血清學(xué)診斷依據(jù)，適合于早期RA的診斷[7，14]。雖然血清RF和抗CCP抗體聯(lián)合檢測大大提高了RA診斷的靈敏度和特異度，仍有10%～20%的患者血清RF和抗CCP抗體均陰性，即血清學(xué)陰性RA[3]。我們的研究中有25.7%的RA患者RF陰性，16.2%的RA患者RF和抗CCP抗體均陰性，這些患者的診斷是臨床的難點。

抗MCV抗體和抗CCP抗體雖然都是抗瓜氨酸蛋白抗體家族的成員，均具有抗原決定簇瓜氨酸。然而，抗CCP的抗原決定簇是人工合成的，分子量僅為波形蛋白的1/20，可被瓜氨酸化的位點少，而抗MCV抗體的靶抗原是具有多個可被瓜氨酸化的天然波形蛋白，從理論上講較抗CCP抗體具有更高的靈敏度和特異度[15]。一項納入了12個中心研究的Meta分析顯示，抗MCV抗體對RA診斷的靈敏度為68.6%，高于抗CCP抗體的靈敏度（61.7%，P<0.001）[16]。本研究顯示，抗MCV抗體在RA患者中的陽性率為77.7%，這與國外Mansour等[17]報道的抗MCV抗體對RA診斷的靈敏度79.6%的結(jié)果一致。本研究還顯示，抗MCV抗體在RF陰性的RA患者中的陽性率可達(dá)46.3%，而在RF和抗CCP抗體均為陰性的血清學(xué)陰性RA患者中的陽性率也有33.3%，提示對于臨床上疑似RA但目前診斷標(biāo)準(zhǔn)中推薦的血清自身抗體均陰性情況下，可進(jìn)一步檢測抗MCV抗體，提高RA患者的檢出率，減少臨床漏診。

RF和抗CCP抗體的水平越高，與RA的相關(guān)性越大，因此2010年的RA分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步將RF和抗CCP抗體分為高、低滴度，并賦予不同的診斷分值[7，18]。在芬蘭人群中進(jìn)行的一項大樣本隊列研究中，發(fā)現(xiàn)抗MCV抗體在早于診斷RA前11年就可在患者血清中檢測到，并且高滴度的抗MCV抗體增加了后期發(fā)展為RA的風(fēng)險[19]。本研究顯示，本組RA患者抗MCV抗體的高滴度陽性率可達(dá)65.5%，高于RF和抗CCP抗體的高滴度陽性率，并且在RF和抗CCP抗體均陰性（血清學(xué)評分0分）的RA患者中，抗MCV抗體低滴度陽性和高低度陽性的患者分別占8.3%和25.0%，而在RF或抗CCP抗體至少1個陽性且均無高滴度陽性（血清學(xué)評分2分）的RA患者中，抗MCV抗體低滴度陽性和高低度陽性的患者分別占9.1%和59.1%，提示進(jìn)一步定量檢測抗MCV抗體水平可提高對RA患者的檢出率。但本研究為單中心研究，樣本量偏少，結(jié)果可能存在一定的偏倚，我們擬繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗證抗MCV抗體對目前RA診斷的補(bǔ)充價值。

總之，抗MCV抗體對目前RA的診斷有一定的補(bǔ)充價值，尤其是對血清學(xué)陰性的患者，有望成為新的RA血清學(xué)輔助診斷指標(biāo)，在臨床推廣應(yīng)用。