黑曲霉β-甘露聚糖酶基因克隆及在畢赤酵母中的表達

章亭洲,王碧嬌,林路成,徐志偉,陸夢甜,易蒲紅,吳石金

(1.浙江科峰生物技術(shù)有限公司,浙江 海寧 314400;2.浙江工業(yè)大學 生物工程學院,浙江 杭州 310014)

β-1,4-D-甘露聚糖酶[β-1,4-D-mannan mannanohydrolase,EC 3.2.1.78],簡稱β-甘露聚糖酶(endo-1,4-β-mannanase),可以隨機水解甘露聚糖中的β-1,4-D-甘露吡喃糖苷鍵。β-甘露聚糖酶在食品、醫(yī)藥、飼料、紡織、紙漿漂白及能源開發(fā)等領(lǐng)域和行業(yè)都得到應(yīng)用,用途十分廣泛。β-甘露聚糖酶在多種生物中均存在,包括動物、植物、微生物等,在不同物種中活性差別較大[1-3]。其中微生物來源的β-甘露聚糖酶不僅可以工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)并高效分離純化制備,還具有活性高、成本低等顯著優(yōu)點,已引起高度的關(guān)注和開發(fā)應(yīng)用[4-7]。例如在飼料加工生產(chǎn)中,甘露聚糖等非淀粉多糖是一組不易被動物利用的碳水化合物。β-甘露聚糖酶具有一般非淀粉多糖酶類的作用,因此,可以作為一種新型的酶制劑應(yīng)用于飼料原料加工,用于消除飼料中甘露聚糖等不容易降解的多糖類,可提高谷物、餅粕類原料的消化能,節(jié)約資源[8]。β-甘露聚糖酶還可以促進動物類胰島素生長因子IGF-I的分泌,因此可以作為一種多功能的促生長劑,促進纖維素的消化、能量吸收和蛋白合成,提高瘦肉率[8]。此外,甘露聚糖分解后可以產(chǎn)生動物益生元功效物質(zhì)甘露寡糖,不僅可以促進腸道內(nèi)有益菌群的形成,還可以調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng),提高動物免疫力,從而降低發(fā)病率[9]。

甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)具有表達效率高、外源基因遺傳穩(wěn)定和可高密度培養(yǎng)等優(yōu)點,已成為優(yōu)良的外源蛋白的真核表達宿主。酵母也是優(yōu)良單細胞蛋白(Single cell protein,SCP)生產(chǎn)菌種,但是由于天然的酵母菌均缺乏水解β-1,4-D-甘露糖苷鍵的酶類,用于飼料原料等行業(yè)的底物加工時不能有效去除甘露聚糖等非淀粉多糖。因此,通過構(gòu)建表達β-甘露聚糖酶的畢赤酵母工程菌,既可作為潛在的單細胞蛋白來源,又可進行工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)甘露聚糖酶，應(yīng)用于多種行業(yè),充分發(fā)揮畢赤酵母可利用工業(yè)發(fā)酵罐水平進行大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)并且能耗低、節(jié)約成本等優(yōu)點,是一條極具潛力的途徑,應(yīng)用前景廣闊[10]。20世紀90年代后期開始國外先后將不同來源的淀粉酶、木聚糖酶基因引入畢赤酵母進行表達,已成功構(gòu)建能分解淀粉和木聚糖的酵母工程菌[10-12]。筆者構(gòu)建了含黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的高效整合型表達載體,轉(zhuǎn)化甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母菌,獲得能高效隨機水解甘露聚糖分子主鏈中的β-1,4-D-甘露糖苷鍵的畢赤酵母基因工程菌,為后續(xù)工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、培養(yǎng)基、酶和主要試劑

黑曲霉(Aspergillusniger)、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株和質(zhì)粒酵母表達載體ppic9K由為筆者實驗室保存;限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq酶均購自TaKaRa公司;IPTG和蛋白質(zhì)標準物購自上海生工;其他常規(guī)化學試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

BMGY培養(yǎng)基:酵母粉10 g,蛋白胨20 g,無氨基酵母氮源YNB 13.4 g,甘油10 mL,0.1 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液100 mL,加蒸餾水至1 L,調(diào)pH至 6.0,121 ℃滅菌20 min。

BMMY培養(yǎng)基:酵母粉10 g,蛋白胨20 g,YNB 13.4 g,甘油 10 mL,生物素0.04 mL,濃度0.1 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液100 mL,加蒸餾水至1 L,調(diào)pH至6.0,121 ℃滅菌20 min,加過濾除菌甲醇5 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶克隆

根據(jù)GenBank中已登錄的黑曲霉β-甘露聚糖酶基因序列預(yù)測氨基酸序列,設(shè)計并合成引物,正反引物兩側(cè)分別帶有EcoR I和NotI酶切位點,反向引物引入6xHis標簽序列。Trizol法提取黑曲霉總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)得到β-甘露聚糖酶基因cDNA,試劑盒純化回收后與pMD18(Takara,大連生物工程公司)克隆載體16 ℃過夜連接,熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,在LB/Amp抗性平板上篩選陽性克隆。獲得重組質(zhì)粒并測序。β-甘露聚糖酶氨基酸序列為MSFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDNADVD-LVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTV-WYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAE-QHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSG-ETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAV-FAWELANEPRCPSCDTSVLYNWIEKTSKFIK-GLDADRMVCIGDEGFGLNIDSDGSYPYQFSEG-LNFTMNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWG-NGWITAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNHC-SVEGSWQKTALSTTGVGADLFWQYGDDLST-GKSPDGGNTIYYGTSDYQCLVTDHVAAIDSA

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建

從獲得測序正確的pMD18-manA上用EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切獲得甘露聚糖酶manA目標基因,同時用EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切畢赤酵母表達質(zhì)粒pPIC9K獲得大片段,膠回收目標基因和載體片段,16 ℃過夜連接,連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,在LB/Amp抗性平板上篩選陽性克隆。菌落PCR驗證獲得陽性克隆并測序。

1.2.3 重組表達載體LiAc法轉(zhuǎn)入畢赤酵母

操作步驟:1) 挑取3～4 mm畢赤酵母單菌落接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基,30 ℃,250 r/min過夜培養(yǎng);2) 以V(菌液)∶V(培養(yǎng)基)=1∶100接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基,30 ℃,250 r/min,培養(yǎng)至OD600至0.4～0.6;3) 于室溫下5 000 r/min離心5 min,將收集的菌體用1倍TE緩沖液洗滌，8 000 r/min離心,將細胞重懸于2 mL Li-Ac/TE緩沖液中,于室溫下放置30 min;4) 在EP管中混合新制備的酵母感受態(tài)細胞100 μL，10 μL carrierDNA，0.1～1.0 g pPIC9K/α-manA(用SacI線性化)和700 μL 40% PEG4000,于42 ℃熱激7 min,轉(zhuǎn)化后的酵母懸浮液離心并重新懸于200 μL1倍TE緩沖液中,取50 μL涂布于MD平板上,平板配置為瓊脂糖20 g/L,YNB 13.4 g/L,葡萄糖20 g/L,生物素4×10-4g/L,G418 1.5 mg/L,于30 ℃下培養(yǎng)3～4 d。

1.2.4 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定與活性篩選

從目的基因序列兩段設(shè)計引物進行PCR擴增驗證,所用引物對為man-F:ACCGACAACGCTGATGTTGACTTGGTTAT,man-R:AACATGA-TCAGTAACCAAACACTGGTAGTC。挑取轉(zhuǎn)化平板上的菌落溶于20 μL去離子水中,取10 μL用反復(fù)凍融法對酵母細胞進行破壁處理后,進行PCR擴增,反應(yīng)體系為25 μL,包括上下游引物各1 μL,12.5 μL含酶混合液Mix,3.5 μL菌液,其余用水補足,以未轉(zhuǎn)化的畢赤酵母鑒定作對照。擴增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;然后以94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min進行30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存。反應(yīng)完成后,取20 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

用接種環(huán)挑取菌PCR結(jié)果正確的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子,提取重組質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌擴繁后送去測序。測序確認正確的畢赤酵母轉(zhuǎn)甘露糖酶基因菌株進行酶活測定研究。

1.2.5 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達、分離純化與SDS-PAGE電泳

1) 誘導(dǎo)表達:將畢赤酵母工程菌在YPD平板上進行活化后,挑選單菌落接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中,于30 ℃,200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600為3.0,約18 h)。以V(菌液)∶V(培養(yǎng)基)=1∶100量接種于50 mL BMGY液體培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后離心收集菌體。將菌體用50 mL BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD600為1.0,加V(無水甲醇)∶V(培養(yǎng)基)=1∶100誘導(dǎo)表達144 h,離心,分別收集菌體和上清液進行蛋白分離純化分析和酶活測定。

2) 分離純化與SDS-PAGE電泳:采用Toyobo公司的His-tag蛋白純化試劑盒進行重組蛋白分離純化。取20 μL含重組蛋白樣品與5 μL 5倍上樣緩沖液混合,緩沖液配置為Tirs-HCl 1 mol/L,pH 8.8,進行SDS-PAGE,蛋白膠用考馬斯亮藍G250染色。

1.2.6 重組β-甘露聚糖酶畢赤酵母工程菌酶活檢測

按照1.2.1～1.2.5方法進行誘導(dǎo)表達后進行工程菌酶活測定,對收集的細胞破碎后測定胞內(nèi)酶活,對收集的胞外培養(yǎng)液進行胞外酶活測定。以2%可溶性魔芋精粉為底物,采用DNS法測定β-甘露聚糖酶的活性。取0.2 mL待測酶液,加入0.8 mL 2%可溶性魔芋精粉溶液作為反應(yīng)底物,底物由pH 5.6的0.1 mol/L乙酸緩沖液配制,m(可溶性魔芋精粉)∶V(乙酸緩沖液)=2 g∶100 mL。70 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)5 min,用0.5 mol/L NaOH溶液滅酶活。加入DNS試劑2 mL,沸水反應(yīng)5 min后冷卻定容至20 mL,測定波長540 nm處光度值。本實驗條件下,定義每10 min產(chǎn)生1 mg還原糖的所需酶量定義為1個酶活單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及檢測

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中β-甘露聚糖酶基因的序列分析,manA的長度為1 149 bp,編碼383個氨基酸的蛋白質(zhì),除去蛋白質(zhì)N端38個氨基酸的信號肽后的序列進行畢赤酵母表達。提取黑曲霉總RNA后,通過RT-PCR擴增得到β-甘露聚糖酶的cDNA序列約1.1 kb,其結(jié)果如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化回收后,與克隆載體pMD18相連轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞,提取陽性克隆后,送至武漢生工公司測序。測序結(jié)果表明,與數(shù)據(jù)庫發(fā)表的manA序列相似性為100%,證明已克隆得到黑曲霉β-甘露聚糖酶基因。

M—DNA分子量標準;1,2,3—3個平行反轉(zhuǎn)錄樣本的PCR擴增片段。

2.2 酵母重組表達載體pPIC9K/α-manA的構(gòu)建與鑒定

從pMD18-manA將目標基因切下并與畢赤酵母表達載體pPIC9K/α連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,進行菌落PCR驗證。由于畢赤酵母表達載體pPIC9K自身帶有胞外信號肽α因子,外源基因β-甘露聚糖酶manA克隆后形成N端融合有分泌信號肽序列的重組表達載體pPIC9K/α-manA,全長重組基因(信號肽α融合manA)為1 338 bp,菌落PCR產(chǎn)物長度和預(yù)期一致,如圖2所示,表明酵母重組表達載體pPIC9K/α-manA構(gòu)建成功。

M—DNA分子量標準;1,2—兩個不同大腸桿菌菌落PCR擴增結(jié)果。

2.3 陽性克隆PCR與篩選結(jié)果

pPIC9K/α-manA通過熱激法轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌株,β-甘露聚糖酶基因畢赤酵母轉(zhuǎn)化子和菌落PCR篩選驗證如圖3所示。從轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子利用反復(fù)凍融法破壁后,進行菌落PCR鑒定,MD選擇性培養(yǎng)基篩選如圖3(a)所示。隨機挑選了8個畢赤酵母轉(zhuǎn)化子菌落,PCR擴增后3號菌落未擴增出目標片段,其余7個轉(zhuǎn)化子均擴增出預(yù)期長度的目標片段,如圖3(b)所示。用接種環(huán)挑取菌PCR結(jié)果正確的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子,提取重組質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌擴繁后進行測序確認,測序結(jié)果表明:β-甘露聚糖酶基因序列正確,β-甘露聚糖酶基因已成功克隆到畢赤酵母中。選擇正確構(gòu)建的轉(zhuǎn)甘露糖酶基因畢赤酵母菌株進行酶活測定研究。

M—DNA分子量標準;1～8—不同菌落的PCR結(jié)果。

2.4 β-甘露聚糖酶基因的在工程菌中的表達

2.4.1 重組酶蛋白的SDS-PAGE檢測

為了進一步檢驗畢赤酵母甘露聚糖酶重組工程菌中的重組酶蛋白的存在,畢赤酵母重組甘露聚糖酶工程菌經(jīng)過培養(yǎng),經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后,利用重組融合蛋白帶有的His-tag標簽進行親和層析蛋白分離純化,得到重組甘露聚糖酶蛋白,進行SDS-PAGE分析,得到了預(yù)期分子量附近的重組表達蛋白,其結(jié)果如圖4所示。

M—分子量標準;1—工程菌胞外液分離純化后的重組蛋白。

2.4.2 重組表達菌株酶活檢測

分別挑取5株含重組表達載體pPIC9K/α-manA和1株含空載體pPIC9K/α的畢赤酵母進行培養(yǎng),誘導(dǎo)表達后,收集菌體,檢測重組菌胞內(nèi)酶活和胞外酶活。由酶活檢測結(jié)果可知:5株重組菌檢測出β-甘露聚糖酶酶活,而對照空載體菌株沒有檢測到酶活,較高一株的酶活測定結(jié)果見表1。

表1 畢赤酵母重組菌和含空載體菌株的甘露聚糖酶活比較

2.5 討 論

甘露聚糖是一種半纖維素類物質(zhì),存在于多種植物組織中,尤其是植物細胞的細胞壁及豆科等植物的種子中。麥類、豆粕、谷物等都是主要的食品和飼料加工原料,這些原料中含有大量的甘露聚糖。甘露聚糖是大分子物質(zhì),極易吸水,在單胃動物消化道內(nèi)易形成凝膠狀,阻礙營養(yǎng)物質(zhì)與消化液的接觸,從而影響消化吸收,降低動物的生產(chǎn)性能[8]。

β-1,4-甘露聚糖酶(β-1,4-mannanase,EC 3.2.1.78)是一類能夠水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖等以β-1,4-D-甘露吡喃糖為主鏈的甘露聚糖的內(nèi)切水解酶。β-1,4-甘露聚糖酶已被廣泛用于飼料、食品、醫(yī)藥、紡織印染、造紙、生物能源、生物基化學品和石油開采等諸多領(lǐng)域,進行甘露聚糖的分解[1-2]。甘露聚糖酶水解產(chǎn)物甘露低聚糖是功能性低聚糖,具有益生元的功效,可以促進人和動物腸道內(nèi)以雙歧桿菌為代表的有益菌的增殖,改善腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu),還可以清除自由基、增強機體抗氧化能力[8-9]。我國是農(nóng)業(yè)大國,富含甘露聚糖的相關(guān)原料資源非常豐富,但是附加值比較低,開發(fā)制備活性較高的甘露聚糖酶以及工業(yè)化處理和生產(chǎn)技術(shù),可用于低聚甘露聚糖等高附加值產(chǎn)品生產(chǎn),提高資源化利用水平。

微生物是β-1,4-甘露聚糖酶的重要來源,但是基于天然微生物進行的傳統(tǒng)甘露聚糖酶生產(chǎn)方法具有產(chǎn)量低、酶比活低、生產(chǎn)成本高等缺點,不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要和日益增長的市場需求[9,13-14]。因此,利用基因工程技術(shù)改造和構(gòu)建甘露聚糖酶基因工程菌是一條極具潛力的途徑,可以解決上述不足之處[15]。巴斯德畢赤酵母是一種真核生物,開發(fā)的表達系統(tǒng)具有表達量高、產(chǎn)物便于分離純化、蛋白活性高等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于外源酶的表達和生產(chǎn)[11,16-18]。

3 結(jié) 論

構(gòu)建了畢赤酵母重組表達甘露聚糖酶的基因工程菌,通過α分泌肽進行N端融合成為重組酶,實現(xiàn)分泌表達。對工程菌進行β-甘露聚糖酶酶活測定后發(fā)現(xiàn),最高胞外酶活為125.78 IU/mL,酶的比活力為188.86 U/mg。研究結(jié)果表明:β-甘露聚糖酶酶基因已在畢赤酵母中成功表達并能有效分泌到細胞外,從而使得下游的重組酶分離純化、利用工程菌直接進行富含甘露聚糖底物的加工利用等更加簡單一些,顯著降低酶的制備和應(yīng)用成本,為進一步工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。