苦參堿調(diào)控Sirt1/FoxO3信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡的機(jī)制研究

熊穎 郭芳 熊宇 張萬里 胡艷艷

胃癌(gastric carcinoma)是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，主要起源于胃黏膜上皮[1]。胃癌的發(fā)病具有區(qū)域和性別的差異性，可能與飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣、幽門螺旋桿菌感染等因素有關(guān)，但其發(fā)病的確切機(jī)制尚不明確[2]。因此，探索胃癌的發(fā)病機(jī)制及胃癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號(hào)通路對(duì)臨床早期診斷及治療具有重要的價(jià)值。FoxO3蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的自噬調(diào)控因子，其活性主要受到沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)的去乙?；{(diào)節(jié)。Sirt1/FoxO3信號(hào)通路與多種病理過程密切相關(guān)，如氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、肥胖和腫瘤等[3,4]。但目前尚未見到Sirt1/FoxO3信號(hào)通路與胃癌細(xì)胞凋亡過程的相關(guān)報(bào)道。苦參堿是為豆科植物苦參的干燥根、植株、果實(shí)經(jīng)乙醇等有機(jī)溶劑提取制成的生物堿，具有抗炎、殺菌、護(hù)肝和利尿的藥理活性[5-7]。本文對(duì)苦參堿促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞凋亡的AKT/FoxO3信號(hào)通路機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床新藥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及分組 SGC7901細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好(37℃，5%CO2)的胃癌SGC7901細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、Nicotinamide組(20 μmol/L)、苦參堿低劑量組(10 μmol/L)、苦參堿高劑量組(40 μmol/L)。Nicotinamide組細(xì)胞給予20 μmol/L的Nicotinamide 4 h，苦參堿低劑量處理組和高劑量組細(xì)胞分別給予10 μmol/L和40 μmol/L的苦參堿處理4 h。計(jì)算各組細(xì)胞的抑制率。抑制率=(對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.2 試劑與儀器 兔抗Caspase-3一抗購自Abcam公司(ab13847)；兔抗Bax(MAB846)及兔抗Caspase-9購自R&D公司(MAB8301)；兔抗Bcl-2(sc7382)一抗購自Santa Curz公司；鼠抗Sirt1一抗購自Invitrogen公司(PA5-17232)；鼠抗FoxO3一抗購自Abcam公司(ab58518)；二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；DAPI及Sirt1抑制劑Nicotinamide購自Sigma Aldrich公司。苦參堿購自中國食品藥品檢定研究院(Matrine，批號(hào)805-200005，純度HPLC≥98%，本文中采用羧甲基纖維素鈉配制成10-3μmol/L濃度工作液后過濾除菌)。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國美墨爾特公司；細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)基購自Gibco公司；冷凍離心機(jī)購自賽多利斯公司；超凈工作臺(tái)購自ESCO公司；移液器購自德國Eppendorf公司；電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀購自北京六一儀器廠；熒光顯微鏡購自徠卡公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將用乙醇清潔并滅菌后的載玻片放入培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中進(jìn)行爬片并進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理。待各組胃癌細(xì)胞爬片并在蓋玻片上生長(zhǎng)良好后，無菌PBS輕輕沖洗3次后用冰丙酮(-20℃放置2 h)固定15 min，于生物安全柜的臺(tái)面上室溫晾干。用1% Triton-100處理各組細(xì)胞爬片1 h增加細(xì)胞的通透性，無菌PBS輕搖漂洗3次；4.0%的胎牛血清白蛋白溶液封閉，加一抗(1∶200)4℃孵育6 h，無菌磷酸鹽緩沖液漂洗3次。將載玻片與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記二抗避光37℃溫孵1 h(1∶300)，PBS漂洗5次后熒光顯微鏡拍照。

1.4 Western Blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá) SGC7901胃癌細(xì)胞培養(yǎng)并進(jìn)行相應(yīng)的化合物孵育后用無菌磷酸鹽緩沖液充分沖洗3次，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白。將總蛋白行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳和半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素膜用4.0%的脫脂牛奶封閉2 h。封閉后將纖維素膜與一抗(1∶200)4℃冰箱中雜交過夜，無菌磷酸鹽緩緩沖液漂洗3次后與辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗20℃反應(yīng)后進(jìn)行顯色。用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行蛋白的相對(duì)定量分析。

1.5 DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 4組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理并爬片培養(yǎng)后進(jìn)行DAPI染色法：將制好的蓋玻片上滴加20 μl的DAPI(100 ng/ml)染液，染色10 min，用滅菌的純化水沖去DAPI染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下(激發(fā)波長(zhǎng)380 nm)觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 DAPI染色分析4組細(xì)胞凋亡情況 苦參堿組細(xì)胞存在凋亡小體(箭頭指向)，且隨著苦參堿劑量的增加，凋亡程度明顯增加；同時(shí)，苦參堿對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用具有劑量依從性效果(P<0.05)。見表1,圖1、2。

表1 苦參堿對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分析

對(duì)照組苦參堿低劑量組苦參堿高劑量組Nicotinamide組

圖2 苦參堿對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分析

2.2 Western Blotting法分析細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3/9表達(dá) 與對(duì)照組比較，苦參堿組細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且隨著劑量的增加，上述蛋白表達(dá)明顯增大(P<0.05)。見表2，圖3。

表2 Western Blotting法分析細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3/9表達(dá)分析

圖3 Western Blotting法分析細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3/9表達(dá)

2.3 Western Blotting法分析細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表達(dá) 與對(duì)照組比較，苦參堿處理組細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯增強(qiáng)而Bcl-2的表達(dá)明顯減弱，且隨著劑量的增加，上述蛋白的表達(dá)變化越明顯(P<0.05)。見表3，圖4。

表3 Western Blotting法分析細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表達(dá)

2.4 Western Blotting法分析Sirt1/FoxO3的表達(dá) 與對(duì)照組比較，苦參堿處理組FoxO3的表達(dá)明顯增強(qiáng)而Sirt1的表達(dá)明顯減弱，且隨著劑量的增加，上述蛋白的表達(dá)變化越明顯(P<0.05)。見表4，圖5。

圖4 Western Blotting法分析細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表達(dá)

表4 Western Blotting法分析Sirt1/FoxO3的表達(dá)

圖5 Western Blotting法分析Sirt1/FoxO3的表達(dá)

2.5 免疫組織化學(xué)法分析Sirt1/FoxO3蛋白的表達(dá) 與對(duì)照組相比，苦參堿處理組FoxO3蛋白的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)而Sirt1蛋白的熒光信號(hào)明顯減弱，且隨著劑量的增加，上述蛋白的表達(dá)變化越明顯(P<0.05)。見表5，圖6、7。

表5 免疫組織化學(xué)法分析Sirt1/FoxO3蛋白的表達(dá)分析

3 討論

胃癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤，且其發(fā)病率和病死率有逐年升高的趨勢(shì)。胃癌的早期患者通常進(jìn)行手術(shù)治療，但臨床上確診的患者通常為中晚期患者，目前尚無特效的治療手段?？鄥A主要成分有苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿等多種生物堿，具有抗氧化和抗腫瘤的效果[8,9]。本文在對(duì)苦參堿促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞凋亡的AKT/FoxO3信號(hào)通路機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，苦參堿細(xì)胞Bax、Caspase-3/9和FoxO3的表達(dá)明顯增強(qiáng)而Bcl-2、Sirt1蛋白的表達(dá)明顯減弱，DAPI染色凋亡小體明顯增多；免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)FoxO3的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)而Sirt1蛋白的熒光強(qiáng)度減弱，且苦參堿的效果有劑量依從性，表明苦參堿可能通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901的細(xì)胞凋亡過程。

對(duì)照組苦參堿低劑量組苦參堿高劑量組Nicotinamide組

Sirt1蛋白表達(dá)

對(duì)照組苦參堿低劑量組苦參堿高劑量組Nicotinamide組

FoxO3蛋白的表達(dá)

圖6 免疫組織化學(xué)法分析Sirt1及FoxO3蛋白的表達(dá)(免疫組化×400)

圖7 免疫組織化學(xué)法分析Sirt1/FoxO3蛋白的表達(dá)分析；與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01

Sirt1/FoxO3信號(hào)通路調(diào)控了細(xì)胞的多種病理及生理過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)，且可能是藥物治療的潛在靶點(diǎn)[4,10]。以往的研究發(fā)現(xiàn)羥胺三唑能夠通過抑制NKκB和激活SIRT1蛋白改善荷瘤小鼠的肌萎縮癥狀，表明SIRT1蛋白參與了此病理過程[11]。Hagenbuchner等[12]研究也發(fā)現(xiàn)在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中細(xì)胞核FoxO3能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管發(fā)生過程，提示FoxO3蛋白可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，與本研究的結(jié)論一致。在分析SIRT1作用的靶點(diǎn)時(shí)也發(fā)現(xiàn)SIRT1能夠通過作用于SREBP1蛋白和脂肪形成過程發(fā)揮其促進(jìn)子宮內(nèi)膜腫瘤增殖的作用[13]。與以往的研究結(jié)論[14-16]一致，本文也發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，苦參堿細(xì)胞Bax、Caspase-3/9和FoxO3的表達(dá)明顯增強(qiáng)而Bcl-2、Sirt1蛋白的表達(dá)明顯減弱，DAPI染色凋亡小體明顯增多；免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)FoxO3的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)而Sirt1蛋白的熒光強(qiáng)度減弱，且苦參堿的效果有劑量依從性，表明苦參堿可能通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901的細(xì)胞凋亡過程。FoxO3蛋白作為腫瘤的抑制因子，可以通過調(diào)節(jié)核糖核苷酸還原酶亞基的表達(dá)來改善腫瘤患者的生存狀態(tài)和預(yù)后，且FoxO3蛋白表達(dá)越高患者預(yù)后越好[17]。同時(shí)，miR-34a/SIRT1/p53反饋循環(huán)也與腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移過程相關(guān)，且長(zhǎng)非編碼RNA分子HNF1A-AS1可以通過調(diào)控miR-34a/SIRT1/p53軸影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程[18]。而本研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2/Caspase-3/9等細(xì)胞凋亡蛋白參與了胃癌細(xì)胞的凋亡過程，而Sirt1/FoxO3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑Nicotinamide組的上述凋亡蛋白的異常表達(dá)得到顯著的恢復(fù)，而與Nicotinamide組細(xì)胞一致，苦參堿組細(xì)胞的上述蛋白的異常表達(dá)也得到明顯的改善，表明苦參堿可能是通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號(hào)通路影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2/Caspase-3/9的表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡過程。在以后的研究中課題組將進(jìn)一步分析此過程中是否有p53蛋白的參與，且通過RNAi進(jìn)一步闡述Sirt1/FoxO3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在苦參堿促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡過程中的參與作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)Sirt1/FoxO3蛋白也是藥物干預(yù)腫瘤的潛在靶點(diǎn)[19,20]。Yan等[21]研究也證實(shí)miR-629可以作用于FoxO3蛋白調(diào)控胰腺癌的進(jìn)展過程，與本研究發(fā)現(xiàn)的苦參堿可以通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡結(jié)論一致。

因此，苦參堿可能通過調(diào)控Sirt1/FoxO3信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901的細(xì)胞凋亡過程。