LncRNA NEAT1調控miR-331表達對鼻咽癌細胞輻射敏感性的影響

梁衛(wèi)勤 林智

鼻咽癌是人體內分泌器官中最為常見的腫瘤類型，發(fā)病率逐年遞增，具有隱匿性強、進展緩慢的特點，部分患者在初次診斷時已發(fā)生轉移[1-3]。文獻報道，鼻咽癌的發(fā)生和癌基因的活化表達相關，因此揭示鼻咽癌相關的基因和調控機制對治療鼻咽癌具有極其重要的意義[4]。長鏈非編碼RNA(long-chain noncoding RNA，lnc RNA)曾被認為不發(fā)揮實際作用，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤細胞周期、腫瘤細胞侵襲轉移與化療耐藥等相關的信號通路方面均發(fā)揮調節(jié)作用[5-8]。作為lnc RNA家族成員之一，非編碼RNA——NEAT1已被證實在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有分化調控的作用[9-11]。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中有諸多非編碼RNA、抑癌基因、促癌基因及蛋白因子的參與，但目前關于NEAT1在鼻咽癌中的作用研究報道甚少，其是否能夠調節(jié)鼻咽癌細胞的放療敏感性筆者尚不清楚。因此，本研究通過對鼻咽癌組織和細胞株的研究，探討NEAT1對鼻咽癌細胞輻射敏感性的分子機制，為新型靶向藥物的研發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本 48例臨床鼻咽癌組織及對應的癌旁組織來自2018年1月至2019年1月于我院接受手術治療的鼻咽癌患者，男26例，女22例；年齡36～65歲，中位年齡52歲；病程3～15周，平均病程(7.2±1.2)周；根據美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)中鼻咽癌病理分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期15例，Ⅲ期10例，Ⅳ期7例；患者同意本研究并簽署知情同意書，且經醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 實驗材料 鼻咽癌細胞株SUNE-1、5-8F、C666-1、CNE-1、CNE-2均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)。siNEAT1及陰性對照siNC穩(wěn)轉干擾細胞系、NEAT1、GAPDH及miR-331引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計完成。DMEM/F12培養(yǎng)基(D8900)，DMEM培養(yǎng)基(D777)，1640培養(yǎng)基(R6504)， L15培養(yǎng)基(L4386)均購自Sigma；SYBR Green 熒光定量PCR 檢測試劑盒(QPK-201)于TOYOBO采購；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027)采購自碧云天；X射線生物輻照儀購自Thermo；Trizol reagent(9009)采購自TaKaRa；Matrigel基質膠(356234)采購自BD。蘇凈Airtech超凈工作臺；SANYO MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡；5810R 型高速離心機；Roche R480實時熒光定量PCR儀。

1.3 細胞轉染 調整鼻咽癌細胞株SUNE-1細胞株濃度至1×106個/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol/L的siNEAT1和陰性對照轉染至細胞，以SUNE-1作為空白對照，得到SUNE-1-siNEAT1及SUNE-1-siNC細胞株。

1.4 qRT-PCR檢測Lnc RNA NEAT1和miR-331的表達 采用Trizol法提取各組細胞總RNA并進行反轉錄，按照PrimeScrip反轉錄試劑盒進行反轉錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應體系，反應條件為：95℃預變性10min，然后95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40 個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。U6作為內參(上游引物為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，Lnc RNA NEAT1(上游引物為 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)，miR-331(上游引物為 5’-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’)相對表達量用2-ΔΔCT表示。每個樣本獨立重復實驗3 次。

1.5 MTT及平板克隆實驗檢測細胞增殖 細胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1經5 Gy電離輻射照射后，按照每孔500～1 000 個密度鋪至96 孔板，輕輕混勻后，置入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加MTT溶液20 μl，37℃避光4 h 后，棄掉孔內液體，再加DMSO各100 μl，置于37℃搖床上快速振蕩15 min，以便充分溶解結晶物，最后將96 孔板置于酶標儀上檢測 492 nm 處的OD值。將上述兩種穩(wěn)轉細胞按每孔5×103個密度鋪6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，隔周更換新鮮培養(yǎng)液，2周后用考馬斯亮藍染色，在顯微鏡下計數菌落形成數量。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲 實驗前12 h更換為無血清培養(yǎng)基，細胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1經10 Gy電離輻射照射后，將40 μl matrigel基質膠鋪于Transwell小室中，消化細胞并用1×PBS清洗2遍，將500 μl完全培養(yǎng)基加入24 孔板，細胞計數，取5×105細胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μl細胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡。置于培養(yǎng)箱內正常培養(yǎng)24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1%結晶紫染液500 μl進行染色，室溫避光15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察顯穿過膜的細胞并拍照計數。

1.7 免疫熒光標記 細胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1經10 Gy電離輻射照射后，分別于0 h、6 h進行免疫熒光檢測，將細胞貼附于載玻片上，PBS清洗后，4%多聚甲醛固定室溫下固定 15 min，再經0.1 Triton X-100室溫通透細胞20 min，2%羊血清室溫封閉1 h，加入γ-H2AX一抗，4℃下孵育過夜，再加入二抗室溫孵育1 h，經DAPI核染色后共聚焦顯微鏡拍照并記錄細胞中綠色γ-H2AX foci數量。

1.8 生物信息學預測和熒光素酶報告基因分析 通過檢索生物信息學網站starBase預測NEAT1與miRNA-331的靶向結合情況。在此基礎上，用 PCR從大鼠星形膠質細胞基因組 DNA中擴增 PI3K的 3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)序列，構建至熒光素酶報告基因載體 pGL3(pGL3-miR-331-WT)中，同時構建突變型重組質粒(pGL3-miR-331-MUT)，將HEK293T 細胞按30%左右密度鋪25孔板，將miRNA-331 mimic及mimic control分別與空載質粒及上述質粒共轉染至HEK293T 細胞。轉染后25 h，根據雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報告基因活性。

1.9 Western blotting檢測 細胞SUNE-1、SUNE-1-siNC及SUNE-1-siNEAT1經10 Gy電離輻射照射后培養(yǎng)48 h，加入適量的RIPA裂解液，裂解30 min，12 000/min 4℃離心10min，收集上清，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入TGF-β、Smad一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h后加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集Fig.像，以GAPDH作為內參，分析蛋白水平。

2 結果

2.1 Lnc RNA NEAT1在不同組織及細胞中的表達 RTFQ-qPCR結果顯示，鼻咽癌組織中 Lnc RNA NEAT1的表達水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； Lnc RNA NEAT1在SUNE-1細胞中表達量最高，與其他細胞株相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。適合使用RNA干擾的方法進行后續(xù)Lnc RNA NEAT1基因功能的研究。見表1、2。

2.2 細胞系構建 qRT-PCR結果顯示SUNE-1組和SUNE-1-siNC組Lnc RNA NEAT1的表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，SUNE-1-siNEAT1組細胞中Lnc RNA NEAT1的表達量明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。提示成功構建NEAT1沉默細胞系。見表3。

表1 Lnc RNA NEAT1在不同組織中的表達

表2 Lnc RNA NEAT1在不同鼻咽癌細胞系中的表達

表3 Lnc RNA NEAT1在SUNE-1細胞中的表達

2.3 Lnc RNA NEAT1對鼻咽癌細胞株SUNE-1輻射敏感性的影響 MTT實驗結果顯示，與SUNE-1組和SUNE-1-siNC組相比，SUNE-1-siNEAT1組經電離輻照后OD492 nm值明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平板克隆實驗結果顯示，電離輻照后，SUNE-1-siNEAT1細胞克隆數顯著減少(P<0.05)。說明Lnc RNA NEAT1被沉默后，能增強鼻咽癌細胞SUNE-1的輻照敏感性。見表4、5，圖1。

表4 平板克隆實驗Lnc RNA NEAT1對SUN-1輻射敏感性的影響

2.4 Lnc RNA NEAT1對電離輻照誘導的鼻咽癌細胞株SUNE-1侵襲能力的影響 Transwell實驗顯示，與空白對照組和SUNE-1-siNC組比較，電離輻照后，SUNE-1-siNEAT1細胞通過matrigel基質膠的數量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結果表明沉默lnc RNA NEAT1后，抑制鼻咽癌細胞電離輻射后的侵襲能力。見圖2，表6。

表5 MTT檢測Lnc RNA NEAT1對SUN-1輻射敏感性的影響

圖1 平板克隆實驗Lnc RNA NEAT1對SUN-1輻射敏感性的影響

圖2 Lnc RNA NEAT1對電離輻照誘導的SUNE-1細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色×200)

表6 Lnc RNA NEAT1對電離輻照誘導的SUNE-1細胞侵襲能力的影響

2.5 Lnc RNA NEAT1與miR-331的作用關系 經starbase數據庫分析發(fā)現(xiàn)NEAT1和miR-331之間有互補結合序列，推測兩者可能具有靶向調控關系。雙熒光素酶報告基因結果顯示，轉染miR-331后，野生型NEAT1的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型NEAT1的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，說明NEAT1和miR-331具有靶向調控關系。見表7，圖3。

表7 熒光素酶報告基因檢測結果

圖3 熒光素酶報告基因檢測結果

2.6 Lnc RNA NEAT1對鼻咽癌細胞株SUNE-1電離輻射誘導DNA 損傷的影響 免疫熒光結果顯示，相比空白對照組SUNE-1和陰性對照組SUNE-1-siNC，SUNE-1-siNEAT1組細胞γ-H2AX的熒光強度更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結果表明沉默lnc RNA NEAT1后，抑制鼻咽癌細胞電離輻射后的DNA損傷的修復作用。見表8，圖4。

表8 Lnc RNA NEAT1對電離輻射致SUNE-1 DNA損傷的影響

圖4 Lnc RNA NEAT1對電離輻射致SUNE-1 DNA損傷的影響

2.7 miR-331在不同細胞中的表達 qRT-PCR檢測穩(wěn)轉干擾細胞系和空白細胞對照中miR-331結果表明，lnc RNA ANCR被沉默后，miR-331表達水平顯著上調(P<0.05)，證實lnc RNA ANCR可以特異性結合miR-331并發(fā)揮負向調控作用。見表9。

表9 miR-331在不同細胞中的表達情況

3 討論

鼻咽癌因其發(fā)病位置比較隱蔽，不容易檢查，且早期癥狀復雜，缺少明顯的特征，所以往往被忽視，導致患者治療時已發(fā)生轉移。大多數晚期鼻咽癌患者經放射治療后仍會復發(fā)或轉移，是治療失敗的主要原因[12,13]，因此研究鼻咽癌的分子機制對于尋找治療靶點具有重要意義。

Lnc RNA NEAT1包含855個核苷酸，位于人類USP46基因上游的4號染色體上，在其基因組2個內含子中間分別產生一個miR4449和一個SNORNA26，但最終成熟的轉錄本中卻并不包含[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)，在成骨細胞分化過程中，NEAT1可結合EZH2以增加Runx2 基因啟動子區(qū)的H3K27me3，進而抑制Runx2的轉錄[16，17]。有研究表明，Lnc RNA NEAT1是一種與癌癥相關的基因，且在多種腫瘤中表達量顯著升高[18]。與正常組織相比，Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌組織中的表達明顯升高，研究證實Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌細胞中表達量均高于人鼻黏膜上皮細胞，表明Lnc RNA NEAT1的異常表達與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。羅泳林等[19]發(fā)現(xiàn)Lnc RNA NEAT1在鼻咽癌中表達水平明顯升高，與本研究結果相符。

有研究表明，乳腺癌細胞中沉默Lnc RNA NEAT1可促進 CDK1激酶與 EZH2 結合，使EZH2的蘇氨酸Thr-345和Thr-487處磷酸化增加，最終導致EZH2的泛素化降解[20，21]。據報道，在輻射誘導的癌細胞模型中，Lnc RNA NEAT1的表達水平出現(xiàn)異常升高，提示Lnc RNA NEAT1的表達與癌細胞經電離輻射后的應激反應有關[22-24]。本研究結果顯示，電離輻射照射后，沉默Lnc RNA NEAT1的鼻咽癌細胞株SUNE-1增殖和遷移能力明顯受到抑制，提示沉默Lnc RNA NEAT1能夠增強鼻咽癌輻射敏感性。電離輻射可引起腫瘤細胞DNA雙鏈斷裂，不能修復的DNA損傷會介導細胞凋亡而被清除，γH2AX作為DNA雙鏈斷裂的標志物，可有效反映DNA損傷程度[25，26]。本研究結果中，沉默Lnc RNA NEAT1后腫瘤細胞γH2AX表達明顯高于對照組，提示抑制Lnc RNA NEAT1的表達可加劇DNA損傷或降低DNA損傷的修復能力。以上結果表明，lnc RNA NEAT1在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用，有望作為該病的治療及預后的標志因子。

微小RNA(MicroRNA，miRNA) 是存在于真核生物中一類長度為18～25 nt的非編碼單鏈小分子RNA，其作用機制主要是直接結合在特定的靶信使RNA的3’非轉錄區(qū)，促使靶RNA發(fā)生降解或者翻譯被抑制，從而調控目的基因的表達。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，種類繁多的miRNA家族成員與人類多種疾病及腫瘤的發(fā)展密切相關[27，28]。miR-331基因位于人類染色體的12q22n上，相關研究證實，miR-331對前列腺癌、胃癌、結直腸癌及宮頸癌均發(fā)揮抑制作用，但在肝癌中促進細胞增殖及轉移進而起到促癌作用，在淋巴細胞白血病中，miR-331表達異常且參與細胞增殖及遷移[29]。lnc RNA NEAT1調控鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否有miR-331參與鮮有報道。lnc RNA對不同細胞具有多向調節(jié)功能，因而在諸多人類疾病中發(fā)揮重要作用，有研究證實了mRNA和lnc RNA之間一種新的調控機制，即兩者的相互影響跟它們競爭共同的miRNA反應元件有關，此時lnc RNA可能發(fā)揮了競爭性內源性RNA的作用，對miRNA進行吸附并調控其靶標，從而使轉錄后調控水平進一步增加[30，31]。本研究同時采用starbase數據庫對lnc RNA NEAT1的靶基因進行預測，分析發(fā)現(xiàn)lnc RNA NEAT1和 miR-331之間存在一定的結合位點，由此推測miR-331可作為lnc RNA NEAT1的下游靶基因。此外采用熒光素酶報告基因實驗檢測miR-331與全lnc RNA NEAT1轉錄本的結合能力，發(fā)現(xiàn)兩者能形成一定的互補堿基對，進一步證實了兩者的靶向關系。RTFQ-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞中沉默lnc RNA NEAT1后，miR-331表達水平顯著上調，證實lnc RNA NEAT1對miR-331發(fā)揮負向調控作用。以上結果表明，在鼻咽癌中l(wèi)nc RNA NEAT1可能通過特異性結合并抑制miR-331的表達進而發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，lnc RNA NEAT1在鼻咽癌中呈高表達，沉默Lnc RNA NEAT1表達可能通過上調miR-331水平抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲能力，增加鼻咽癌細胞輻射敏感性。