堿處理蟲膠涂層的血液相容性和細胞活性研究

任 倩，覃利娜，景鳳娟，謝 東，黃 楠，冷永祥

(1. 西南交通大學 材料科學與工程學院，材料先進技術(shù)教育部重點實驗室，成都 610031；2. 西南交通大學 物理科學與技術(shù)學院，成都 610031)

0 引 言

蟲膠(Shellac)又稱紫膠，是一種熱帶昆蟲紫膠蟲分泌的天然樹脂。蟲膠主要由75%～85%的紫膠樹脂、4%～8%的紫膠色素和5%～6%的紫膠蠟組成，除此之外還含有少量的糖類、蛋白質(zhì)、鹽類等雜質(zhì)[1]。紫膠樹脂又分為硬樹脂和軟樹脂，硬樹脂由聚酯組成，軟樹脂則主要是單酯的混合物。蟲膠與多種材料均具有較強的結(jié)合力，且防水、防潮、防紫外線，可塑性強，沒有毒性和刺激性，具有良好的成膜性能和保護性能，因此廣泛應用于食品藥品領域，如用作食物添加劑、上光被膜劑和腸溶包衣等[2]。蟲膠具有良好的生物相容性，研究顯示，蟲膠并未降低內(nèi)皮細胞(EC)和平滑肌細胞(SMC)的細胞活性[3]。蟲膠具有可降解性能[4]。蟲膠涂層在醫(yī)療器械表面改性領域也受到關(guān)注。蟲膠已被應用于藥物洗脫血管支架中，通過釋放抗增生的西羅莫司或普羅布考藥物，減少了血管內(nèi)膜增生和炎癥[5]。研究者[6-7]采用基質(zhì)輔助脈沖激光蒸發(fā)制備出了具有良好附著力的蟲膠薄膜。但是蟲膠脆性較大，限制了其在一些醫(yī)療器械表面改性領域的應用[8]。Sontaya等用氫氧化鈉、氫氧化銨等對蟲膠進行堿處理，發(fā)現(xiàn)處理后的蟲膠聚酯鏈斷裂成單酯，最大應力降低、應變增加，使其柔韌性得到了改善[9]。

目前還未見過堿處理后蟲膠涂層的成分、結(jié)構(gòu)、結(jié)合力、血液相容性和細胞相容性等相關(guān)報道。本研究對蟲膠進行堿處理后制備涂層，研究了蟲膠涂層的成分、結(jié)構(gòu)、與基體的結(jié)合力、表面潤濕性等，并對堿處理后的蟲膠涂層的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞活性及增殖行為、血小板粘附行為和溶血性能等進行了分析評價，以探究蟲膠涂層在心血管材料與器械表面改性方面的可行性。

1 實 驗

1.1 涂層制備及材料學表征方法

蟲膠堿處理：依據(jù)文獻[8]，采用NaOH溶液對蟲膠(Sigma，US)進行堿處理。具體過程如下：將10 g蟲膠粉末加入0.5 mol/L的NaOH溶液中，在室溫下采用磁力攪拌器攪拌30 min后，將2 mol/L HCl溶液倒入燒杯中進行中和，至堿處理蟲膠以沉淀形式完全析出。用大量清水洗凈堿處理后的蟲膠，于50 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥24 h。

蟲膠涂層制備：前期研究發(fā)現(xiàn)TiCu薄膜[10]具有良好的生物相容性和耐久性能，因此本研究在TiCu薄膜表面制備蟲膠涂層，以改善器械的血液相容性和抑制內(nèi)膜增生。其中TiCu薄膜的Cu含量為40%(原子分數(shù)), 厚度約為200 nm。制備蟲膠涂層時，首先將蟲膠粉末溶解于無水乙醇中，制備蟲膠溶液(11.24%(質(zhì)量分數(shù)))。然后將表面沉積有TiCu薄膜的硅片置于勻膠機吸片臺固定，用移液槍吸取50 μL蟲膠溶液滴于樣品表面，使勻膠機低速500 r/min運行20 s后，高速3 500 rpm再運行40s。制備好的樣品置于50 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥3～4 h取出，所得樣品于室溫下保存。

采用表面輪廓儀(AMBIOS XP-2，US)分析蟲膠涂層的厚度。采用傅立葉紅外光譜(NICOLET 5700，US)對蟲膠涂層的表面官能團和結(jié)構(gòu)進行分析。蟲膠涂層的測試模式為衰減全反射模式(Attenuated Total Reflection，ATR)，測試波長范圍500～4 000 cm-1。采用X射線光電子能譜分析(ESCALAB 250Xi，US )對蟲膠涂層的化學元素及價態(tài)進行分析，XPS設備陽極靶為鎂靶，全譜通過能100 eV、步長為1.0 eV，窄譜30 eV、步長為0.05 eV，分析室的真空度為2×10-7Pa。采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡 (JSM 7800F JEOL，Japan)分析蟲膠涂層的表面形貌。采用接觸角測定儀(JY-82)測量涂層的表面接觸角。

采用劃痕實驗和彎曲實驗評價蟲膠涂層與基體的結(jié)合力。劃痕實驗中，采用多功能材料表面性能試驗儀(MFT-2000，US)進行載荷劃痕試驗，利用一定形狀的硬質(zhì)針狀壓頭以連續(xù)增加的正壓力刻劃涂層，直至涂層失效，通過對失效處及劃痕形貌進行分析來評價薄膜和基體的結(jié)合力。其中最大載荷為30N，加載速率30 N/min，劃痕長度5 mm。彎曲實驗中，將蟲膠溶液(11.24%質(zhì)量分數(shù))分別浸涂在鍍有TiCu薄膜的316 L不銹鋼絲(φ=0.1 mm)表面后，在直徑為2 mm的塑料圓棒上進行繞軸彎曲和纏繞，隨后采用SEM觀測表面形貌以評價蟲膠涂層與基體的結(jié)合狀況。

1.2 內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞活性與增殖行為評價

在蟲膠涂層表面分別體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，時間為1-3天。采用細胞計數(shù)試劑盒CCK-8表征內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的活性，采用免疫熒光染色評價其細胞形態(tài)?；钚詸z測：在樣品表面均勻接種細胞，種植密度為(內(nèi)皮細胞：1×104cells/mL，平滑肌細胞：1×104cells/mL)，培養(yǎng)1、3天后將孔板中的培養(yǎng)基吸盡，用生理鹽水清洗3次，在避光的條件下加入300 μL 的CCK-8試劑，于孵箱中培養(yǎng)3～4 h。用移液槍吸取200 μL液體于96孔板中，利用酶標儀于450nm處檢測其吸光度值。觀測：將培養(yǎng)1、3天的細胞培養(yǎng)基吸盡，用生理鹽水清洗3次，加入2.5%的戊二醛進行固定后取出用生理鹽水清洗3次，在避光條件下加入50 μL羅丹明進行染色，時間為15～20 min。隨后用生理鹽水清洗3次后將樣品吹干，于倒置熒光顯微鏡下進行觀察。

此外，采用涂層的浸提液進行內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞培養(yǎng)，評價其內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞活性和增殖行為。具體方法：將樣品置于孔板中，按照表面體積浸提比為1.25 cm2/mL的標準加入培養(yǎng)基，于37 ℃、5%的CO2孵箱中孵育24 h，得到浸提液。將內(nèi)皮細胞(或平滑肌細胞)接種到24孔板中，種植密度為1×104cells/mL，培養(yǎng)6～8 h后細胞形態(tài)正常且貼壁生長后，將培養(yǎng)基吸出加入浸提液進行培養(yǎng)。采用上述的CCK-8方法和免疫熒光染色分別評價其內(nèi)皮(或平滑肌)細胞活性與形態(tài)。

1.3 血小板粘附行為和溶血行為評價

采用血小板粘附和溶血實驗評價蟲膠涂層的血液相容性[11]。

血小板粘附：將健康人血離心(轉(zhuǎn)速1 500 r/min、時間15 min)，得到富含血小板的血漿(Plasma rich in Platelets，PRP)。將50～100 μL 的PRP加入樣品表面，使樣品表面完全覆蓋，于37℃恒溫孵箱中孵育30 min后，用生理鹽水清洗3次，加入2.5%的戊二醛固定4h。用羅丹明對表面的血小板進行染色，時間為15～20 min。染色后，用生理鹽水清洗3次后將樣品吹干，于倒置熒光顯微鏡下對血小板粘附情況進行觀察。樣品于真空干燥箱中干燥24 h后，采用掃描電子顯微鏡觀察和評價其表面的血小板形貌。

溶血實驗：向樣品中加入9.8 mL NaCl并置于37 ℃水浴鍋中進行預熱30 min。于4 mL的全血中加入5 mL的NaCl將新鮮血液進行稀釋，混合均勻。取9.8 mL NaCl(0.9%)和RO水分別作為陰性對照和陽性對照。取0.2 mL稀釋后的全血分別加入陰性對照、陽性對照和實驗組，于37 ℃孵箱中孵育1h。將孵育后的液體加入新的離心管中進行離心(轉(zhuǎn)速3 000 rpm、時間5 min)。取離心后的上清液加入96孔板中(每孔150 μL)。用酶標儀測量其在540 nm波長處的吸光度值。按照公式(1)，計算出每個樣品的溶血率。

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 堿處理蟲膠涂層的厚度、成分結(jié)構(gòu)、表面形貌及表面潤濕性等分析

通過表面輪廓儀對涂層的厚度分析后顯示，堿處理后蟲膠涂層的厚度約為1 122.5 nm。

采用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)檢測了堿處理后的蟲膠涂層的表面官能團和表面結(jié)構(gòu)。圖1(a)的紅外圖譜顯示，3 429 cm-1處為典型羥基-OH的伸縮振動吸收峰; 在2 934 cm-1和2 860 cm-1處有兩個尖銳的峰，是甲基或亞甲基的C-H振動峰; 1 716 cm-1處為酸和酯中羰基的伸縮振動吸收峰[12]；1 633 cm-1處為殼腦酸與羧基共軛的C=C雙鍵的伸縮振動吸收峰[8]；1 465 cm-1為紫膠桐酸中-CH2的變形振動吸收峰[13]；1 416 cm-1為羧酸O-H鍵變形振動吸收峰。未觀察到COO-Na在1 540～1 600 cm-1處[14]的特征吸收峰。

采用XPS對堿處理后蟲膠涂層的表面化學鍵合狀態(tài)進行了分析。圖1(b)為蟲膠涂層的C1S 圖譜，結(jié)果顯示 284.8 eV處為C-C/C-H的峰，285.7和286.7 eV處的峰分別為C-O-C羥基醚和O-C=O/C-O羰基峰，289.1 eV處的峰為COOH羧基峰。

采用SEM觀察了堿處理后的蟲膠涂層的表面形貌。圖1(c)結(jié)果顯示涂層表面較為平滑，在較高倍數(shù)下可看到蟲膠涂層干燥時形成的微裂紋。

圖1 堿處理蟲膠涂層的(a)全反射傅立葉紅外光譜(ATR-FTIR)圖譜；(b)XPS C1s高分辨圖譜；(c) SEM觀察到的表面形貌；(d)水接觸角和極性分量色散分量和表面能(γs)Fig 1 ATR-FTIR spectrum, XPS C1s spectrum, SEM image, and water contact angle and surface energy (γs ) and their polar and dispersive components ) of the alkali-treated shellac coatings

2.2 涂層與基底的結(jié)合力

2.2.1 劃痕實驗

涂層與基底之間的結(jié)合力對涂層的質(zhì)量有著重要影響，韌性好、與基底結(jié)合強度高的涂層抵抗界面裂紋產(chǎn)生和擴展能力更強，其服役壽命更長[16]。本文采用劃痕實驗評價堿處理后涂層的結(jié)合力，采用堿處理前的蟲膠涂層作為對照樣(厚度約為1119.0 nm，與堿處理后接近)。圖2的劃痕形貌顯示，當力加載到堿處理前的蟲膠涂層表面時，涂層隨即產(chǎn)生褶皺，隨著加載力不斷增大，至15N左右時(a2)，涂層邊緣開始發(fā)生結(jié)合力失效，失效范圍逐漸擴大，至30 N力完全加載上去時(a3)，涂層發(fā)生了大面積的失效，并且末尾有涂層碎屑堆積。而堿處理后的蟲膠涂層中，隨著加載力不斷增大，蟲膠涂層的頭部、中部和尾部均沒有發(fā)生邊緣涂層失效的情況，說明堿處理提高了蟲膠涂層與基體的結(jié)合力。蟲膠堿處理后軟樹脂的含量增多，最大應力降低、應變增大、柔韌性增加[9]，有利于改善蟲膠涂層與基體結(jié)合力。

2.2.2 彎曲實驗

采用彎曲實驗進一步評價蟲膠涂層與基體的結(jié)合力。彎曲試驗是檢測涂層抗拉強度、耐沖擊性和與基底之間附著力的綜合實驗[17]。具體方法：將鍍有TiCu薄膜的不銹鋼絲浸沒于堿處理后的蟲膠溶液(11.24%(質(zhì)量分數(shù))，溶劑為乙醇)中1 min后取出，在真空干燥箱中干燥24 h，然后在軸棒(φ=2mm)上彎曲，采用SEM對彎曲后的樣品表面進行分析。圖3的結(jié)果顯示，所有彎曲后的蟲膠涂層均未發(fā)生碎裂和脫落現(xiàn)象，顯示了較好的結(jié)合力。

圖2 (a)堿處理前和(b)堿處理后的蟲膠涂層的劃痕形貌Fig 2 Surface morphology of the untreated shellac coatings and alkali-treated shellac coatings after scratching tests

圖3 采用浸涂法在鍍有TiCu薄膜的不銹鋼絲表面制備蟲膠涂層，然后繞軸(φ=2 mm)彎曲后進行觀察。(a)采用照相機獲得的形貌；(b、c)采用SEM觀察到的堿處理后蟲膠涂層的表面形貌Fig 3 The alkali-treated shellac coatings were prepared on the surfaces of TiCu- coated stainless steel wires using dip coating method, and then bent around the axis of the plastic stick with diameter of 2 mm: the surface morphology observed by camera and the surface morphologies evaluated by SEM

2.3 涂層的血小板粘附行為和溶血行為

理想的心血管材料與器械涂層應具有良好的血液相容性，對血液成分無損害、不凝血、不溶血、不形成血栓等[18]。目前還未見到蟲膠涂層血液相容性的相關(guān)研究。本文評價了堿處理后蟲膠涂層的體外血小板粘附行為和溶血性能。圖4(a)和(b) 的熒光鏡顯微鏡和血小板的統(tǒng)計數(shù)量顯示，蟲膠涂層表面粘附的血小板數(shù)量比不銹鋼表面明顯減少，但與TiCu表面沒有明顯區(qū)別。圖4(c)的掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，316L SS表面的血小板呈現(xiàn)出有較多偽足的樹枝狀鋪展形態(tài)，而在TiCu和TiCu-Shellac(A)表面血小板呈現(xiàn)出無偽足的圓形和僅有部分偽足伸出的樹枝狀形態(tài)。根據(jù)血小板粘附過程形態(tài)變化分析[19]， TiCu薄膜和TiCu-Shellac(A)樣品表面的血小板激活程度較低。以上結(jié)果顯示，堿處理后蟲膠涂層TiCu-Shellac(A)具有較好的抑制血小板粘附和激活的能力。

圖4 不銹鋼(SS)、TiCu 薄膜(TiCu)、堿處理蟲膠涂層(TiCu-Shellac(A))樣品表面的(a)血小板熒光染色顯微鏡圖像；(b)血小板粘附量統(tǒng)計結(jié)果；(c)血小板形態(tài)掃描電鏡圖像Fig 4 The fluorescence staining images, the statistical results and SEM images of adhered platelet number on the surfaces of SS, TiCu and Ticu-shellac (A) samples

溶血實驗用來評價材料的體外急性溶血性能。當材料植入人體后與血液接觸時，其中的有毒成分將導致紅細胞破裂，引起血紅蛋白釋放，稱為溶血現(xiàn)象。溶血還會引起毒性反應和血小板聚集，溶血釋放的磷脂將進一步促進血栓的形成[20]。測試材料與血液接觸過程中血紅蛋白的釋放量，可以測得材料的溶血率，按照醫(yī)學標準規(guī)定的要求，當材料溶血率小于5%時，認為材料符合植入條件。圖5(a)為樣品與血液接觸1h后，將孵育后的液體離心得到的紅細胞沉淀情況。陽性對照RO水離心后試管中溶液呈紅色，管底無紅細胞殘留，為完全溶血狀態(tài)。陰性對照樣品NaCl離心后，上清液無色澄明，紅細胞全部沉淀，為不溶血狀態(tài)。SS、TiCu、TiCu-Shellac(A)與陰性對照樣品離心后的狀態(tài)接近，上清液澄明且有紅細胞沉淀。通過測量上清液中血紅蛋白含量，得到各樣品的溶血率，如圖5(b)所示，SS、TiCu、TiCu-Shellac(A)的溶血率分別為0.12%、0.79%、0.53%，均低于5%。研究結(jié)果表明SS、TiCu 和TiCu-Shellac(A)涂層具有較低的溶血率，符合安全條件。

圖5 陽性對照(RO)、陰性對照(NaCl)、不銹鋼(SS)、TiCu 薄膜(TiCu)和堿處理蟲膠涂層(TiCu-Shellac(A))樣品與血液接觸1h后，將孵育后的液體離心，(a)離心后試管中的液體形貌；(b)檢測上清液后獲得不同樣品的溶血率Fig 5 The samples were incubated in blood at 37℃for 1 h, and then the incubated solution were centrifugated at 3000 rpm for 5 min and the supernatants were used for the determination of the hemolysis rate: the erythrocytes precipitation in the tube after centrifugation, and the hemolysis rate for the samples of negative control RO water, positive control NaCl and the samples of SS, TiCu, and TiCu-shellac (A)

2.4 涂層的平滑肌細胞活性與增殖行為

平滑肌細胞過度增殖和遷移會導致血管內(nèi)膜增生，從而導致心血管器械如血管支架內(nèi)再狹窄和植入失敗，也會增加靜脈血栓濾器的取出難度[21-22]。因此，這些材料與器械表面應具有抑制平滑肌細胞的活性與增殖的能力。本文通過CCK-8試劑盒評價了蟲膠涂層對平滑肌細胞活性和增殖的影響。圖6(a)是在樣品表面培養(yǎng)平滑肌細胞1天和3天后平滑肌細胞的CCK-8活性結(jié)果。結(jié)果顯示，培養(yǎng)1天時蟲膠涂層樣品TiCu-Shellac(A)與316L SS相比，平滑肌細胞活性受到抑制。至3天時，蟲膠涂層樣品TiCu-Shellac(A)表面的平滑肌細胞活性受到顯著抑制，且與1天相比平滑肌細胞活性幾乎無增長，說明其平滑肌細胞增殖受到了明顯的抑制。圖6(b)是所有樣品表面熒光染色后的結(jié)果，結(jié)果顯示，在316L SS 和TiCu薄膜表面，平滑肌細胞形態(tài)正常，均為長梭形。在蟲膠涂層TiCu-Shellac(A)樣品表面，未發(fā)現(xiàn)明顯的平滑肌細胞。說明蟲膠涂層TiCu-Shellac(A)能夠明顯抑制平滑肌細胞的活性和增殖。

圖6 平滑肌細胞在不銹鋼(SS)、TiCu 薄膜(TiCu)、堿處理蟲膠涂層(TiCu-Shellac(A))、無細胞的空白組(Blank control)的樣品表面培養(yǎng)1天和3天后，其細胞活性檢測結(jié)果(a)和熒光染色顯微圖像(b)；平滑肌細胞在不銹鋼(SS)、TiCu 薄膜(TiCu)、堿處理蟲膠涂層(TiCu-Shellac(A))、無材料的空白組(Medium)的浸提液(100%、50%)中培養(yǎng)1天后，其細胞活性檢測結(jié)果(c)和熒光染色顯微圖像(d)(* P<0.05, ** P<0.01，***P<0.001)Fig 6 Viability and fluorescence staining microscopic images of SMCs cultured on the surfaces of SS, TiCu, TiCu-shellac(A) samples and cell-free medium(blank control)for 1 and 3 days. Viability and fluorescence staining microscopic images of SMCs cultured in the leaching solution with varied concentration (100%, 50%) for the SS, TiCu, TiCu-shellac(A) samples and material-free medium (medium) for 1 day. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)

為了分析蟲膠涂層的浸提液對平滑肌細胞活性和增殖行為的影響，取各樣品在培養(yǎng)基中浸泡1天后獲得浸提液(100%)，將其稀釋一半后獲得50%的浸提液。對這兩種浸提液分別進行平滑肌細胞體外靜態(tài)培養(yǎng)。圖6(c)和(d)分別是浸提液(100%、50%)中的平滑肌細胞活性和熒光染色的形貌。由圖6(c)可見，經(jīng)過1天的培養(yǎng)后，與SS和TiCu樣品相比較，TiCu-Shellac(A)樣品的兩種浸提液(100%、50%)的平滑肌細胞活性均明顯被抑制，但是50%浸提液的平滑肌細胞活性比100%浸提液有明顯提高。圖6(d)的平滑肌細胞形貌顯示在SS和TiCu浸提液的樣品表面為長梭形，但蟲膠涂層的兩種浸提液中的細胞未見明顯鋪展狀態(tài)，表明細胞有所損傷。涂層表面和浸提液的細胞培養(yǎng)結(jié)果表明，蟲膠涂層通過培養(yǎng)過程中發(fā)生降解進入浸提液，抑制了平滑肌細胞的活性和增殖，但是當浸提液濃度下降后其抑制程度有所減弱。

2.5 涂層的內(nèi)皮細胞活性與增殖行為

植入心血管器械如血管支架表面的內(nèi)皮細胞化可以降低再狹窄的風險[23]。但對于一些心血管器械如靜脈血栓濾器來說，內(nèi)皮細胞過度生長將使靜脈濾器支撐桿與腔靜脈內(nèi)膜粘連，增加了濾器取出的難度[24,25]，因此要降低其內(nèi)皮化程度。圖7 (a)和(b)是在樣品表面培養(yǎng)內(nèi)皮細胞1天和3天后內(nèi)皮細胞活性和相關(guān)的熒光染色后的表面形貌。從圖7(a)可以看出，在培養(yǎng)1天后蟲膠涂層樣品TiCu-Shellac(A)與SS相比，呈現(xiàn)出較好的內(nèi)皮細胞活性。但是培養(yǎng)至第3天時，TiCu-Shellac(A)樣品的內(nèi)皮細胞活性受到明顯抑制，并且與1天相比內(nèi)皮細胞活性無明顯增加，未顯示細胞增殖行為。圖7(b)顯示在培養(yǎng)1天后的樣品表面呈現(xiàn)正常內(nèi)皮細胞的橢圓形和鋪路石狀，但在培養(yǎng)3天后的表面未觀察到明顯的內(nèi)皮細胞。

圖7 內(nèi)皮細胞在不銹鋼(SS)、TiCu 薄膜(TiCu)、堿處理蟲膠涂層(TiCu-Shellac(A))樣品、無細胞的空白組(Blank control)表面培養(yǎng)1天和3天后，其內(nèi)皮細胞活性檢測結(jié)果(a)和熒光染色顯微圖像(b)；內(nèi)皮細胞在不銹鋼(SS)、TiCu 薄膜(TiCu)、堿處理蟲膠涂層(TiCu-Shellac(A)) 、無材料的空白組(Medium)的浸提液(100%、50%)中培養(yǎng)1天后，其細胞活性檢測結(jié)果(c)和熒光染色顯微圖像(d)(*P<0.05, **P<0.01，***P< 0.001)Fig 7 Viability and fluorescence staining microscopic images of ECs cultured on the surfaces of SS, TiCu and TiCu-shellac samples, and cell-free medium(blank control)for 1 and 3 days. Viability and fluorescence staining microscopic images of ECs cultured in the leaching solution with varied concentration (100%, 50%) for the SS, TiCu, TiCu-shellac(A) samples and material-free medium (medium) for 1 day. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)

同樣，為了分析蟲膠涂層的浸提液對內(nèi)皮細胞活性和增殖行為的影響，分別在濃度為100%和50%的浸提液中培養(yǎng)1天，評價涂層浸提液的內(nèi)皮細胞活性。圖7(c)和(d)分別是浸提液(100%、50%)中的內(nèi)皮細胞活性和熒光染色的形貌。圖7(c)的CCK-8結(jié)果顯示，蟲膠涂層樣品TiCu-Shellac(A)與SS相比，內(nèi)皮細胞活性受到明顯抑制，在將浸提液的濃度降低了一半后，內(nèi)皮細胞活性明顯增加。由圖7(d)的浸提液的形貌也顯示出同樣的結(jié)果。因此，蟲膠涂層通過降解在浸提液中抑制了內(nèi)皮細胞活性，但通過降低蟲膠降解浸提產(chǎn)物的濃度能夠一定程度上提高內(nèi)皮細胞活性。

本研究中的堿處理蟲膠涂層能夠明顯抑制平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的活性，不溶血，能夠在一定程度抑制血小板的粘附和激活，有望借鑒并應用在心血管器械如靜脈血栓濾器等表面改性領域。下一步將通過控制蟲膠涂層的結(jié)構(gòu)和厚度等，改變其降解浸提液的濃度，研究其對細胞行為的影響。

3 結(jié) 論

研究采用旋涂方法成功制備出堿處理的蟲膠涂層并對其成分、結(jié)構(gòu)、結(jié)合力和生物相容性等進行了評價。結(jié)果顯示，該涂層為親水性涂層，表面較為平滑。與未堿處理的蟲膠涂層相比較，堿處理蟲膠涂層與基體的結(jié)合力明顯改善。與不銹鋼相比較，蟲膠涂層可以明顯抑制血小板的粘附與激活。蟲膠涂層溶血率小于5%。相對于不銹鋼和TiCu薄膜，堿處理后的蟲膠涂層能夠明細抑制平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞活性和增殖，有望借鑒并應用在與血液接觸的器械如靜脈血栓濾器等表面改性領域。