人不同程度疲勞狀態(tài)唾液蛋白標(biāo)志物的肽譜研究

許巖麗，肖迪，張慧芳，尹天露，何利華，高曉歡，顧一心，彭賢惠，劉志軍，張建中*

本研究價值：

本研究發(fā)現(xiàn)人不同程度疲勞狀態(tài)唾液標(biāo)志物的肽譜在分子量2 000～15 000 Da范圍內(nèi)有差異峰，為后期進行基于蛋白質(zhì)組學(xué)的疲勞標(biāo)志物的研究打下了良好的基礎(chǔ)。本研究所探索的分子量2 000～15 000 Da范圍疲勞相關(guān)生物標(biāo)志物思路，則同時具備了待測物成分穩(wěn)定、體內(nèi)干擾因素少和檢測體系易于轉(zhuǎn)換和普及的特點，所涉及的疲勞相關(guān)生物標(biāo)志物的探索更具有現(xiàn)實意義和應(yīng)用前景。后期本課題組將建立疲勞隊列，利用目前成熟的生物質(zhì)譜高通量樣品分析技術(shù)找到疲勞狀態(tài)下穩(wěn)定、特異的生物標(biāo)志物和生物標(biāo)志物組合，建立疲勞-相關(guān)生物標(biāo)志物評價模型；相對以往大多數(shù)唾液代謝組學(xué)研究，蛋白組學(xué)結(jié)果具有更穩(wěn)定性優(yōu)勢，進一步研究有望系統(tǒng)建立可用于疲勞識別的唾液標(biāo)志譜，特別是為進一步實現(xiàn)基于生物傳感器技術(shù)等的便捷疲勞檢測方法提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

疲勞的流行病學(xué)研究結(jié)果顯示：我國每年因疲勞死亡人數(shù)多達60萬，導(dǎo)致早亡的壽命損失也大于任何一種疾病。疲勞造成的直接、間接總體損失和社會代價巨大［1］，但迄今未能找到便捷的檢測方法和手段。雖然許多國家在積極開展職業(yè)性疲勞檢測的研究工作，西方發(fā)達國家也投入了巨大的人力、物力，但疲勞具有漸進性、數(shù)據(jù)難以客觀獲得、測量方法和評價指標(biāo)難以量化等特征［2-3］。在已有的疲勞檢測方法研究中，疲勞生理信號的檢測雖然靈敏度較高但有侵入性，且需要提取信號粘貼電極；眼動追蹤中眼睛閉合占某一特定時間的百分率（PERCLOS）法測量準確率高，對行為特征的檢測直觀明了，但檢測識別的方法復(fù)雜，對于瞳孔測量信息提取困難，對視線方向和嘴部狀態(tài)等的檢測受個體、光線和生理狀況影響差異較大，可靠性差、抗干擾性也差。最近報道的日本芯片技術(shù)、美國的車載模塊系統(tǒng)等雖提升了疲勞檢測效率，但因設(shè)計復(fù)雜和性價比等原因，普及性差［4-5］。近期BHATTI等［6-7］通過醫(yī)生的尿液研究發(fā)現(xiàn)，相比于夜間睡覺者，夜間工作（定義為：晚上工作8 h后，在第2天6：00以后換班）者DNA損傷的修復(fù)程度非常低，僅是夜間睡覺者的20%左右。但尿液取樣不便，且受腎功能及飲水的影響，不適宜代償性生理指標(biāo)的檢測。到目前為止，比較所有疲勞檢測方法，尚無便捷、可靠、無侵入性、性價比也高的檢測方法，如果能有一個或一組客觀的臨床標(biāo)志物來協(xié)助診斷將會具有極為重要的意義，這既是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點和難點，也是發(fā)展中國家和發(fā)達國家共同面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一。

其實，疲勞的研究跨越了生理學(xué)、分子生物醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、計算機技術(shù)、影像學(xué)等領(lǐng)域，本次研究就是在以往各學(xué)科研究基礎(chǔ)上，結(jié)合了當(dāng)前實驗分析技術(shù)的最新發(fā)展和實現(xiàn)快速檢測的技術(shù)需求，選擇了臨床收集方便和無創(chuàng)的唾液作為檢測標(biāo)本并進行了實驗探索［8-10］。相對于有創(chuàng)性的血液檢測以及受腎臟等因素影響的尿液檢測，由腺體分泌的唾液更具穩(wěn)定性，且方便取樣。目前國內(nèi)、外開始對唾液成分分析用于疲勞測定的前景給予了高度關(guān)注，如日本富山大學(xué)和企業(yè)合作開發(fā)通過檢查唾液判定疲勞程度，比測量腦波的方法簡便。已有研究顯示在疲勞狀態(tài)下唾液神經(jīng)節(jié)苷脂、皮質(zhì)醇等小分子可呈現(xiàn)規(guī)律變化，但尚難以建立便捷的檢測體系，且研究所得指標(biāo)為小分子物質(zhì)，較不穩(wěn)定，不利于后期疲勞檢測的推廣應(yīng)用。因此本研究利用目前比較成熟的唾液飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)，探索疲勞狀態(tài)與非疲勞狀態(tài)下有差異的大分子量肽段，為研究疲勞更加便捷、穩(wěn)定的標(biāo)志物提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 納入標(biāo)準 正常健康人，簽署知情同意書，年齡30～45歲，男女不限，無器質(zhì)性疾病和慢性疲勞癥狀；排除標(biāo)準：（1）持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的疲勞持續(xù)6個月以上；（2）咽喉疼痛；（3）頸部或腋下淋巴結(jié)腫痛；（4）肌肉疼痛；（5）多發(fā)性非關(guān)節(jié)炎性疼痛；（6）頭疼；（7）睡眠障礙；（8）勞累后不適持續(xù)24 h以上；（9）口腔疾??；（10）近3個月內(nèi)服用藥物及膳食營養(yǎng)補充劑；（11）吸煙和近1周內(nèi)接受過補牙治療。

1.2 一般資料 符合納入標(biāo)準的正常健康志愿者10人，年齡30～45歲，性別：男5人，女5人。自愿參加本項研究并簽署知情同意書，收集唾液樣本時間為2013年4月10—12日。本研究已經(jīng)過河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準（日期：2013-03-12）。本研究臨床試驗注冊號：ChiCTR-DCD-14005746。

1.3 唾液樣本采集 （1）唾液標(biāo)本取樣：使用唾液收 集 管（ISO9001 certified.CRYO.STM Greiner Bio-One GmbH.Maybachstr.2.72636 Frickenhausen.Gemany E-mail：info@de.gbo.com www.gbo.com/bioscience），醫(yī)生分別于接班前（工作前）和長時間（≥18 h）工作后采樣。采樣前用蒸餾水漱口消除殘留物，再用0.9%氯化鈉溶液漱口3次，1 min/次，結(jié)束后靜坐5 min；采樣時志愿者坐在鏡子前，保持垂直坐位，頭稍向前傾并保持眼睛張開狀態(tài)，然后做咀嚼運動以刺激唾液的分泌，當(dāng)有一定量的唾液積聚在下頜部后，舌抵上顎，張口，舌頭自然翹起，下嘴唇唑成一個“V”型，使唾液自然流入事先準備好的唾液收集管中；收集2 ml唾液，并記錄實驗時采樣與進食的時間間隔及食譜特征。（2）唾液標(biāo)本儲存：由科研助手進行記號標(biāo)記，-70 ℃冰箱保存。（3）唾液標(biāo)本檢測：由中國疾病與預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所國家重點實驗室（MALDI-TOF MS）完成檢測。

1.4 腦電圖檢測與數(shù)據(jù)采集 在長時間（≥18 h）工作后采集腦電圖，檢測是否出現(xiàn)疲勞波（慢波增加，快波降低，即delta波和the 波alpha波和 beta波數(shù)量進行比對）。出現(xiàn)疲勞波，立即采集唾液。腦電圖采集使用SOLAR太陽電子科技有限公司腦功能監(jiān)護系統(tǒng)公司生產(chǎn)的SOLAR-RTA 、SOLAR-BFM腦功能監(jiān)護系統(tǒng)，并進行腦電功能實時分析、腦功能綜合分析。

1.5 唾液蛋白標(biāo)志物肽譜分析 試劑和儀器：WCX磁珠試劑盒：Bruker公司。α-氰基-4-羥基肉桂酸〔α-Cyano-4-hvdroxycinnamicacid（HCCA）〕：Bruker公司，質(zhì)量濃度0.3 g/L；乙醇（色譜級）/丙酮（色譜級）=2/1，新鮮配制。AutoFlexIII型MALDI-TOF質(zhì)譜儀：Bruker公司。WCX磁珠處理過程：從4 ℃冰箱取出WCX磁珠試劑盒，處理過程參照試劑盒說明書，主要經(jīng)混勻、清洗及洗脫等步驟。最后將洗脫的多肽樣品溶液移入干凈的0.5 ml樣品管中，備質(zhì)譜分析。 點樣及質(zhì)譜分析：將磁珠分選后的多肽樣品溶液及唾液原液各取1 μl分別點靶，室溫下干燥后再各加入1 μl濃度為3 g/L的α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液（溶于50%乙腈，2%三氟乙酸）；將制備好的點樣板置于MALDI-TOF質(zhì)譜儀上進行分析；應(yīng)用線性模式，采集分子量范圍為1 000～10 000 Da，激光能量為20%，累計400 shots；質(zhì)譜信號單次分別以磁珠富集（MB）的唾液和離心后直接取上清液（原液）的唾液進行質(zhì)譜分析；掃描累加50次，獲得肽質(zhì)量指紋圖（PMF）。

質(zhì)量控制：試驗前對課題組成員進行相關(guān)培訓(xùn)。詳細告知志愿者試驗情況，發(fā)志愿者胸卡，設(shè)立唾液收集指導(dǎo)和監(jiān)督，每一位進行唾液采樣的人員需要接受嚴格的統(tǒng)一的采唾液訓(xùn)練，志愿者能夠自己采集樣本，腦電圖和睡眠剝奪監(jiān)督由專人負責(zé)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采集分子量范圍為1～15 000 Da，選擇標(biāo)準品進行分子量校正。模型建立及盲篩試驗：使用Bruker公司提供的Clin Pro Tools（3.3.0版本）軟件（遺傳算法）建立模型并驗證。

2 結(jié)果

2.1 通過對10人份合格的志愿者唾液樣本（晨起，漱口后分泌；下午下班前漱口后分泌）采用WCX MB和原液直接檢測兩種樣品處理方式進行飛行時間質(zhì)譜分析，獲得如下實驗結(jié)果：磁珠和直接采樣均在2 000～15 000 Da之間具有很好的譜圖，富集會丟失部分峰。每個人早、晚的譜圖均有差異，由于樣本份數(shù)有限，暫未行交叉驗證，因此每個樣本采兩張譜圖，早晚各用20張譜圖建模分析：在原液樣本兩組間發(fā)現(xiàn)有3個差異肽（見圖1～8）。

2.2 模型識別 分別以MB的唾液質(zhì)譜和原液的唾液質(zhì)譜建模，其建模分布見圖8，MB模型的交叉效度為92.06%，原液模型的交叉效度為95.49%（見表1）。

圖1 原液檢測：在超過15 000 Da區(qū)域幾乎沒有檢測峰Figure 1 Raw liquid detection：there is almost no detection peak in the area over 15 000 Da

圖2 不同個體樣品間存在共同的肽峰Figure 2 Common peptide peaks exist among different individual samples

3 討論

圖3 個體1早晚樣品圖譜比對Figure 3 Comparison of sample Atlas of individual 1 in the morning and evening

精神和軀體疲勞會導(dǎo)致操作人員由適任狀態(tài)衰退成亞適任和不適任狀態(tài)，類似醉酒后失去正?；顒踊蚬ぷ鞯哪芰?，是各國面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一。全球每年因疲勞導(dǎo)致的傷害占職業(yè)性傷害的21.7%，所致死亡占交通死亡的57.0%；但迄今未建立類似酒駕檢測的無創(chuàng)、便捷的疲勞檢測技術(shù)。澳大利亞悉尼大學(xué)健康研究中心利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對采集的腦電圖信號進行處理，發(fā)現(xiàn)疲勞時Theta波明顯增加，這為檢測疲勞提供了依據(jù)，一直被譽為檢測疲勞的金標(biāo)準，可作為診斷性試驗的參考，但其提取信號必須用接觸人體的電極［11］。雖然FUKUDA等［12］制定的診斷疲勞標(biāo)準被國際醫(yī)學(xué)界公認為金標(biāo)準，但涉及腦電圖Theta波、心電圖高頻（HF）及低頻（LF）/HF的比率變化等［13-15］。以往研究疲勞診斷裝置多集中在駕駛防瞌睡裝置［16］、眼動測量系統(tǒng)［17］、機動車駕駛員疲勞測評方法［18］、TI公司高速圖像處理芯片TMS320DM642的疲勞檢測預(yù)警系統(tǒng)等方面，但是成本較高價格昂貴，推廣普及的局限性大。本研究應(yīng)用飛行時間質(zhì)譜儀對多個個體不同疲勞狀態(tài)下唾液樣品行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)譜圖有顯著差異，磁珠和直接采樣均在2 000～15 000 Da內(nèi)獲得良好譜圖，在組間發(fā)現(xiàn)3個差異肽，唾液肽譜隨著疲勞的出現(xiàn)表現(xiàn)出明顯的變化并呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，此結(jié)果強烈支持通過唾液標(biāo)志肽分析進行疲勞識別具有可行性。本研究分別以MB的唾液質(zhì)譜和原液的唾液質(zhì)譜建模，結(jié)果MB模型的交叉效度為92.06%，原液模型的交叉效度為95.49%，而二者可接受度均為100%。

圖5 個體3早晚樣品圖譜比對Figure 5 Comparison of sample Atlas of individual 3 in the morning and evening

圖6 個體4早晚樣品圖譜比對Figure 6 Comparison of sample Atlas of individual 4 in the morning and evening

圖7 MB（磁珠富集）與原液（離心后直接取上清液）唾液質(zhì)譜圖Figure 7 MB （magnetic bead enrichment） and the saliva mass spectrogram of the original liquid （after centrifugation）

圖8 兩種建模的分布Figure 8 The distribution of two kinds of modeling

表1 兩組模型的基本信息及交叉效度與可接受度（%）Table 1 The basic information and cross validity and acceptability of the two groups of models

國外唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)引起廣泛關(guān)注［19］，目前其已經(jīng)運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從正常人的全唾液中成功鑒定出309種蛋白。通過對發(fā)現(xiàn)的309種唾液中蛋白的功能分類，發(fā)現(xiàn)最多的還是功能未知的蛋白（占28.7%），而免疫相關(guān)的蛋白占21%，其中同蛋白復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的蛋白占1.6%，細胞動力和分泌相關(guān)蛋白的占4.8%，轉(zhuǎn)錄和核糖相關(guān)的蛋白占2.3%，細胞繁殖和細胞循環(huán)相關(guān)的蛋白占4.2%，信號傳導(dǎo)蛋白占9.7%，代謝相關(guān)蛋白占5.2%，細胞骨架及內(nèi)膜相關(guān)蛋白占7.1%。作為一種成分復(fù)雜、具有多種生物學(xué)功能的重要體液，唾液中獨特、豐富的蛋白質(zhì)成分毫無疑問是潛在的腫瘤及其他疾病理想的生物標(biāo)志物。長期以來，原有的技術(shù)限制了口腔唾液蛋白的通量分析和精確測定，致使大多數(shù)唾液蛋白的生物功能處于未知狀態(tài)，唾液在人體疾病診斷和預(yù)后判斷中的潛在作用并未顯現(xiàn)。高通量、高精度的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使得從唾液蛋白中標(biāo)記用于疾病的早期診斷或預(yù)防、生物蛋白靶向治療、預(yù)后監(jiān)測判斷等的肽段成為可能［20］，而這也是本研究選用唾液的理論基礎(chǔ)。

疲勞是復(fù)雜的生化過程，單一生化指標(biāo)無法準確地判斷機體是否疲勞。唾液的蛋白組學(xué)研究為通過唾液檢測疲勞提供了新的研究方向。唾液中含有多種生物活性成分，包含部分可用于疾病診斷的生物標(biāo)志物。相比于血液和尿液，唾液的收集過程更為簡便且其收集過程具有完全無創(chuàng)的優(yōu)點。唾液代替血液、尿液在無創(chuàng)疾病診斷中的作用已日益顯現(xiàn)。已有研究顯示在疲勞狀態(tài)下唾液神經(jīng)節(jié)苷脂（分子量為1 563.85 Da）、皮質(zhì)醇（362.47 Da）等小分子可呈現(xiàn)有規(guī)律變化，但尚難以建立便捷的檢測體系。國內(nèi)、外開始對唾液成分分析用于疲勞測定的前景給予了高度關(guān)注，如日本富山大學(xué)和企業(yè)合作開發(fā)通過檢查唾液判定疲勞程度，較測量腦電波的方法更簡便。

疲勞的發(fā)生機制比較復(fù)雜，既往研究認為其是多種感染、應(yīng)激等引起神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)功能紊亂的結(jié)果，近期研究進一步發(fā)現(xiàn)遺傳、代謝等方面的因素也可能參與其中，也有多項研究對長時間運動期間血液化學(xué)成分的變化進行了調(diào)查，但因其確切的病因未明及其生物標(biāo)志物分子用作診斷、預(yù)防、治療指標(biāo)的金標(biāo)準尚未找到，因此目前尚沒有被普遍認可的疲勞程度客觀評估標(biāo)準，一個理想的疲勞程度評估標(biāo)準應(yīng)當(dāng)可用于實時無創(chuàng)性評估，并具有高靈敏度和高穩(wěn)定性，像快速識別檢測酒駕一樣，才能有效預(yù)防和減少因疲勞導(dǎo)致的生命和安全隱患。唾液可以非侵入方式方便獲得，目前國內(nèi)外針對唾液成分變化的研究較少，大部分集中在運動員和士兵唾液代謝產(chǎn)物濃度變化及代謝組學(xué)研究，而且在醫(yī)療領(lǐng)域，疲勞的研究還是一個被邊緣化的問題［21］，研究主要集中在對分子量低于1 000 Da的小分子物質(zhì)的分析［22-25］。以往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的與疲勞相關(guān)的指標(biāo)有皮質(zhì)醇、睪丸素、脫氫表雄酮等，均為小分子物質(zhì)，較不穩(wěn)定，不利于后期疲勞檢測的推廣應(yīng)用。KUME等［26］通過大鼠建立疲勞模型，發(fā)現(xiàn)與限食組的大鼠相比，疲勞組大鼠的纈氨酸（分子量為117.15 Da）、亮氨酸（131.18 Da）和異亮氨酸（131.17 Da）顯著增加，瓜氨酸和羥脯氨酸含量顯著降低；疲勞組大鼠血漿總一氧化氮水平升高，提示全身氧化應(yīng)激；此外，疲勞組大鼠血漿代謝產(chǎn)物參與檸檬酸循環(huán)，如順烏頭酸、異檸檬酸降低。有研究利用數(shù)理模型分析從數(shù)十種代謝產(chǎn)物中篩出慢性疲勞綜合征組和健康對照組有差異的指標(biāo)如cisaconitate、socitrate、citrate、malate［27］。RA 等［28］通過代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)進行 3 d的足球比賽后運動員唾液中存在可以作為疲勞標(biāo)志物的代謝產(chǎn)物，即3-甲基組氨酸（3M-His）、葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），以及一些氨基酸類化合物，但其未對這些標(biāo)志物的診斷效能進行分析。KATAOKA等［24］用自動在線管內(nèi)固相微萃?。⊿PME）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）同時測定唾液中睪酮、皮質(zhì)醇、脫氫表雄酮，發(fā)現(xiàn)對40 μl樣品進行處理，SPME與LC-MS/MS方法具有良好的線性關(guān)系（r≥0.999 8）、精密度（日內(nèi)和日間精密度分別為4.9%和8.5%）和檢測靈敏度（定量限分別為約0.01、0.03和0.29 ng/ml唾液），同時用這種方法對壓力和疲勞狀態(tài)下唾液中的睪酮、皮質(zhì)醇和脫氫表雄酮的水平變化進行分析，顯示了質(zhì)譜技術(shù)的測定優(yōu)勢。

小分子激素類或代謝產(chǎn)物類物質(zhì)的變化雖可能與疲勞有一定關(guān)聯(lián)性，但易受到飲食和其他健康狀況的影響；同時這些小分子標(biāo)志物常不具有良好的抗原性，不易將精密儀器分析發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物改用免疫學(xué)或生物傳感器等簡便方法進行測定。本研究應(yīng)用飛行時間質(zhì)譜儀對多個個體不同疲勞狀態(tài)下唾液樣品行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)譜圖有顯著差異，磁珠和直接采樣均在2 000～15 000 Da內(nèi)獲得良好譜圖，并在組間發(fā)現(xiàn)3個差異肽，唾液肽譜隨著疲勞的出現(xiàn)表現(xiàn)出明顯的變化并呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，此結(jié)果強烈支持通過唾液標(biāo)志肽分析進行疲勞識別具有可行性。本研究所得出的蛋白標(biāo)志物分子量范圍為后期找到大分子量的蛋白質(zhì)組打下了良好基礎(chǔ)，且因大分子量指標(biāo)更穩(wěn)定，為后期找到類似于酒駕檢測標(biāo)志物的疲勞檢測指標(biāo)提供了理論基礎(chǔ)。

據(jù)《日本經(jīng)濟新聞》報道［29］，人在感到疲勞時，血液中的特殊激素糖皮質(zhì)素的含量就會增加，因此唾液里會分泌出α-淀粉酶，而被稱為“心儀”的儀器裝有一個芯片，可通過將人的唾液放在芯片上，再將芯片粘貼到儀器上來檢測疲勞程度。MICHAEL等［30］研究的唾液樣本來自于9名在休養(yǎng)訓(xùn)練期間參與一項旨在模擬長時間體力勞動、軍事行動和火災(zāi)救援工作的交叉研究的自行車手，結(jié)果表明：參試者疲勞生物標(biāo)志物指數(shù)（FBI）值的分布差異度隨著體力活動時間的延長而減小。自我報告的疲勞程度與參與者腦脊液（CFS）和健康對照血清瘦素（16 000 Da）水平呈顯著正相關(guān)，支持主要假設(shè)；機器學(xué)習(xí)算法區(qū)分高在CFS組78.3%精度低疲勞的日子［31］。相關(guān)研究通過探討不同指標(biāo)對高強度間歇訓(xùn)練時疲勞和恢復(fù)的常規(guī)評估的變化發(fā)現(xiàn)肌酸激酶（42 000 Da）在疲勞及恢復(fù)期的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義［32］。本研究結(jié)果從側(cè)面證實了以上研究結(jié)果的正確性。

作者貢獻：許巖麗、張建中進行文章構(gòu)思與設(shè)計；肖迪、張慧芳負責(zé)關(guān)鍵技術(shù)和肽譜分析；何利華、顧一心、彭賢惠進行實驗室操作、唾液樣品前期處理、實驗數(shù)據(jù)收集；尹天露、高曉歡負責(zé)資料匯總、數(shù)據(jù)處理、論文撰寫及修訂；張建中、劉志軍負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。