長(zhǎng)春西汀對(duì)慢性腦缺血大鼠神經(jīng)功能保護(hù)機(jī)制的研究

王 剛，仲婷婷，蔣 毅，陳璽龍，王小琴，王慧云

慢性腦缺血(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是指由各種病因誘發(fā)的腦血流長(zhǎng)期灌注不足，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病程中起關(guān)鍵作用[1]。慢性腦缺血的早期臨床表現(xiàn)主要為記憶下降及逐漸進(jìn)展的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙，病理?yè)p傷機(jī)制及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確，嚴(yán)重影響病人及家屬的日常工作及生活[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，慢性腦缺血發(fā)病率在我國(guó)呈現(xiàn)逐年增高趨勢(shì)，其原因與現(xiàn)代人群飲食方式改變及老齡化進(jìn)程加劇有關(guān)[3]。因此，對(duì)慢性腦缺血發(fā)病機(jī)制及治療方案的研究，已成為臨床亟待解決的問題。臨床對(duì)慢性腦缺血發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、突觸異常、炎癥損傷、能量代謝障礙等方面[4]；對(duì)其神經(jīng)功能保護(hù)方面，研究主要集中在是神經(jīng)再生、神經(jīng)再生障礙、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抑制性因子等方面，雖已取得了可喜的成果，但仍存在部分不足[4]。有研究表明，長(zhǎng)春西汀有明顯的“益智作用”，并對(duì)腦缺血后神經(jīng)功能具有一定的保護(hù)作用[5]。本研究觀察長(zhǎng)春西汀對(duì)慢性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為臨床治療慢性腦缺血提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康成年Wistar 大鼠30只，雄性，鼠齡 3～4 個(gè)月，體重(270±30)g，動(dòng)物領(lǐng)取后置于潔凈飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)1周開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)濕度 70%，溫度(22±3) ℃，自由飲水，晝夜正常交替。

1.2 試劑與儀器 長(zhǎng)春西汀注射液[商品名：潤(rùn)坦，河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20041792，規(guī)格：每支2 mL(20 mg)]；Nogo-A一抗、OMgp一抗及MAG一抗均購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司；兔抗大鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)抗體、兔抗大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 抗體、兔抗小鼠白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；LEICA ASP200S自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó))；LEICA EG1150H 組織包埋機(jī)(德國(guó))；LEICA圖像采集分析系統(tǒng)(德國(guó))。

1.3 分組及造模 30只Wistar 大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組及長(zhǎng)春西汀組，每組10只，模型組及長(zhǎng)春西汀組使用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性阻斷法(bilateral common carotid artery permanent occlusion，2VO)[6]制作大鼠慢性腦缺血模型。方法：大鼠術(shù)前12 h禁食、禁水，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，頸正中切開后，鈍性分離游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分別結(jié)扎其遠(yuǎn)心端、近心端，從中間剪斷，以確保頸總動(dòng)脈無血流通過，縫合切口，術(shù)后各組大鼠均在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。假手術(shù)組以相同方法行頸前皮膚切開，分離、暴露但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，逐層縫合切口。長(zhǎng)春西汀組于2VO術(shù)后 24 h內(nèi)給予長(zhǎng)春西汀10 mg/kg腹腔內(nèi)注射，假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水注射，共注射21 d。

1.4 觀察指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定各組大鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-10、TNF-α含量；使用免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)組織中勿動(dòng)蛋白 (Nogo-A)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)表達(dá)情況；采用免疫組化法結(jié)合圖像分析，檢測(cè)各組大鼠海馬CA1區(qū)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較 模型組及長(zhǎng)春西汀組腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量均高于假手術(shù)組(P<0.05)，IL-10含量則均低于假手術(shù)組(P<0.05)；長(zhǎng)春西汀組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量低于模型組(P<0.05)，IL-10含量則高于模型組(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠腦組織中IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較(±s) 單位：ng/mL

2.2 各組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達(dá)比較 假手術(shù)組及長(zhǎng)春西汀組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達(dá)均低于模型組(P<0.05)；長(zhǎng)春西汀組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達(dá)比較(±s)

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達(dá)比較 假手術(shù)組及長(zhǎng)春西汀組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達(dá)均高于模型組(P<0.05)；長(zhǎng)春西汀組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達(dá)比較(±s)

3討 論

慢性腦缺血是臨床常見病，多發(fā)于中老年人群，主要臨床癥狀可表現(xiàn)為頭暈、視物不清、頭重等，嚴(yán)重時(shí)可造成病人神經(jīng)功能損傷，對(duì)病人正常工作及身心健康影響極大[7]。慢性腦缺血病理過程復(fù)雜，是因慢性腦灌注下降導(dǎo)致腦功能障礙的臨床綜合征，相對(duì)于急性或亞急性腦缺血，其具有可干預(yù)時(shí)間窗較長(zhǎng)的特點(diǎn)，如能早期診斷并積極治療，可有效阻斷疾病進(jìn)展，降低腦血管相關(guān)事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。有研究表明，在腦灌流不足所誘發(fā)的系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中，免疫炎癥反應(yīng)可貫穿腦損傷的全過程[10-11]。而在多梗死灶型血管性癡呆及阿爾茨海默病病人外周血中，炎性因子含量均異常，表明炎性因子參與腦灌注不足所誘發(fā)的系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程[12]。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腦缺血時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)使被激活的巨噬細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等釋放大量的IL-1β、TNF-α，從而激活促炎反應(yīng)[10，13]。IL-1β、TNF-α在腦缺血損傷中的作用已有很多相關(guān)報(bào)道，而IL-10在腦缺血損傷中的作用報(bào)道相對(duì)較少。本研究對(duì)大鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-10、TNF-α含量進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，模型組及長(zhǎng)春西汀組腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量均高于假手術(shù)組(P<0.05)，IL-10含量則均低于假手術(shù)組(P<0.05)；長(zhǎng)春西汀組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α 含量低于模型組(P<0.05)，IL-10含量則高于模型組(P<0.05)。表明長(zhǎng)春西汀可抑制慢性腦缺血大鼠炎癥反應(yīng)，有利于減輕缺血、缺氧對(duì)神經(jīng)元的損害。中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的再生能力，但軸突再生抑制因子可阻礙神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)，而Nogo-A、OMgp及MAG 是機(jī)體主要的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子，在慢性腦缺血時(shí)Nogo-A、OMgp及MAG表達(dá)明顯增強(qiáng)[14-15]。大腦海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)保護(hù)因子對(duì)腦區(qū)神經(jīng)元缺血損傷較為敏感，而BDNF通過與其受體TrkB的結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16-17]。VEGF則通過與其受體 VEGFR2結(jié)合，發(fā)揮促進(jìn)微血管生成及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，使受損病變區(qū)域血供恢復(fù)，進(jìn)而修復(fù)受損神經(jīng)元[18-19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG陽(yáng)性表達(dá)最高，長(zhǎng)春西汀組次之，假手術(shù)組則最低；假手術(shù)組及長(zhǎng)春西汀組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達(dá)均高于模型組(P<0.05)；長(zhǎng)春西汀組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.05)。證實(shí)長(zhǎng)春西汀對(duì)慢性腦缺血大鼠神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能是通過抑制Nogo-A、OMgp及MAG過度表達(dá)，促進(jìn)大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，長(zhǎng)春西汀通過抑制慢性腦缺血大鼠炎性反應(yīng)及大腦海馬區(qū) Nogo-A、OMgp 、MAG 的表達(dá)，促進(jìn)大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。