高糖培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞創(chuàng)傷后Cyclin D1的表達(dá)

陳 晨，趙楠楠，符麗君，朱振華，閻 沖，祝家昌，修 皓

0引言

糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract)是糖尿病常見的并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者視力障礙。目前我國是全球糖尿病人數(shù)最多的國家，2017年糖尿病人數(shù)為1.14億，預(yù)計(jì)到2045年將達(dá)到約1.5億[1]。晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡是除先天性白內(nèi)障以外的所有類型白內(nèi)障發(fā)生的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[2]。晶狀體上皮細(xì)胞是晶狀體內(nèi)代謝最活躍的部分，該細(xì)胞呈單層排列，為晶狀體的生長、分化和損傷修復(fù)等提供基礎(chǔ)物質(zhì)及代謝能量。一旦正常生理功能被破壞，晶狀體纖維排列紊亂，晶狀體則出現(xiàn)混濁[3]。糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，研究表明40mmol/L葡萄糖能夠顯著上調(diào)晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡[4]，其中細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表達(dá)可影響細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為，在細(xì)胞周期進(jìn)程中，Cyclin D1是G1期細(xì)胞周期素，其含量受生長因子等因素的調(diào)控，呈周期性變化[5]。本研究在體外不同濃度的高糖條件下培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞，探究其在創(chuàng)傷后Cyclin D1的表達(dá)，揭示Cyclin D1與糖尿病性白內(nèi)障之間可能存在的關(guān)系，為今后研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEB3)購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司；細(xì)胞總RNA及總蛋白提取試劑盒購自Magen公司；四甲基偶氮唑(MTT)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、青霉素/鏈霉素、熒光定量PCR試劑盒、蛋白Marker購自Ferentas公司；特異性引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；兔源Cyclin D1一抗、山羊抗兔二抗購自Abcam公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液購自于Biosharp公司；BCA法蛋白定量測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：熒光定量PCR儀[(FQD-48A(A4)，杭州博日科技有限公司]；超微量分光光度計(jì)(N50 Touch，德國Implen)；凝膠成像儀(ChemiDoc XRS，BioRad)；雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(DYY-8C，北京六一儀器廠)；A2生物安全柜(SG403A-HE，美國BAKER公司)；連續(xù)波長酶標(biāo)儀(Epoch，美國Biotek公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HLEB3細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)觀察細(xì)胞的生長情況，48h換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長接近90%融合時(shí)，按1∶3比例傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖活力將處于對數(shù)生長期的HLEB3細(xì)胞按1×103個(gè)/孔密度接種于96孔板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞長滿后，更換為含有不同終濃度葡萄糖[5.5(對照組)、10.5、15.5、25.5、30.5mmol/L]的培養(yǎng)液，并設(shè)空白調(diào)零孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在各孔中加入MTT(5mg/mL)10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h。棄去上清液，加入DMSO溶液150μL，低速振蕩10min，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570nm處讀取吸光度值，記錄每組調(diào)零后的吸光度值，根據(jù)每組的平均吸光度值評估細(xì)胞在不同葡萄糖濃度下的增殖活力。

1.2.3高糖預(yù)處理?xiàng)l件下細(xì)胞創(chuàng)傷刺激后Cyclin D1表達(dá)情況根據(jù)細(xì)胞增殖活力的測定結(jié)果，本研究最終選用25.5mmol/L葡萄糖濃度作為高糖模型的處理濃度。將處于對數(shù)生長期的HLEB3細(xì)胞接種于10個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，第2d換用含25.5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞至細(xì)胞長滿(1～3d)(高糖預(yù)處理組)，預(yù)處理后的細(xì)胞分為劃傷組(進(jìn)行劃傷處理)和對照組(不進(jìn)行劃傷處理)，分別于劃傷后0、12、24、48、72h收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。

1.2.4非高糖預(yù)處理?xiàng)l件下細(xì)胞創(chuàng)傷刺激后Cyclin D1表達(dá)情況將處于對數(shù)生長期的HLEB3細(xì)胞接種于10個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h，第2d繼續(xù)用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞長滿(1～3d)(非高糖預(yù)處理組)，換用含25.5mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基，同時(shí)將細(xì)胞分為劃傷組(進(jìn)行劃傷處理)和對照組(不進(jìn)行劃傷處理)，分別于劃傷后0、12、24、48、72h收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。

1.2.5 qRT-PCR法檢測Cyclin D1 mRNA的表達(dá)胰蛋白酶消化細(xì)胞后按照試劑說明書提取總RNA，進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。將所得cDNA濃度稀釋至250ng/μL后進(jìn)行熒光定量PCR。引物序列：Cyclin D1引物F：CTCGGTGTCCTACTTCAAATGT，R：TCCTCGCACTTCTGTTCCT，該引物來自于NCBI比對結(jié)果(NM_053056.2)；β-actin引物F：ACCCTGAAGTACCCCATCGAG，R：ACATGATCTGGGTCATCTTCTCG，該引物來自于參考文獻(xiàn)[6]。反應(yīng)體系為25μL：2×SYBGreen Master Mix 12.5μL，正反向引物各1μL，cDNA 1μL，ddH2O補(bǔ)齊至25μL。反應(yīng)程序采用三步法進(jìn)行擴(kuò)增：50℃ 2min；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 15s，40個(gè)循環(huán)，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)以避免偶然因素影響，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.2.6 Western blot法分析Cyclin D1蛋白表達(dá)情況胰蛋白酶消化細(xì)胞后按照試劑說明書逐步操作提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，于-80℃保存。將提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1～2h，加入兔抗人Cyclin D1一抗(1∶10000)，4℃孵育過夜，PBST沖洗3次后加入山羊抗兔二抗(1∶10000)，室溫輕微震蕩孵育2h，PBST沖洗3次，黑暗條件下加入ECL反應(yīng)5～15min，在BioRad化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光1～15min，以β-actin為內(nèi)參。

2結(jié)果

2.1不同濃度葡萄糖對細(xì)胞增殖活力的影響MTT檢測結(jié)果顯示，一定濃度的葡萄糖會(huì)使HLEB3細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，其中25.5mmol/L葡萄糖處理HLEB3細(xì)胞24h時(shí)細(xì)胞的增殖活力出現(xiàn)最大值，濃度超過25.5mmol/L葡萄糖處理HLEB3細(xì)胞24h細(xì)胞的增殖活力下降，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇25.5mmol/L葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞(圖1)。

2.2高糖預(yù)處理細(xì)胞創(chuàng)傷刺激后形態(tài)變化倒置顯微鏡下觀察高糖預(yù)處理組和非高糖預(yù)處理組細(xì)胞在劃傷刺激條件下不同時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)變化(圖2)，結(jié)果顯示，劃傷后0h，劃傷處兩組細(xì)胞形態(tài)無明顯差別，均呈均勻單層貼壁生長，形態(tài)規(guī)則，劃傷處邊緣細(xì)胞有少量細(xì)胞呈漂浮狀，劃痕中間無細(xì)胞生長。劃傷后12、24h，兩組細(xì)胞形態(tài)并無多大差別，劃傷處邊緣的細(xì)胞已經(jīng)重新貼壁，并開始向外

圖1 不同濃度葡萄糖對晶狀體上皮細(xì)胞增殖活力的影響。

圖2 倒置顯微下觀察劃傷處理不同時(shí)間細(xì)胞形態(tài)變化(×100)。

表1 高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)情況

生長，劃傷處由不平整逐漸趨于平滑，但高糖預(yù)處理組細(xì)胞數(shù)量明顯少于非高糖預(yù)處理組。隨著時(shí)間延長，劃傷處產(chǎn)生細(xì)胞凸起，劃痕間距明顯縮小。劃傷后48h，兩組細(xì)胞形態(tài)有明顯差異，非高糖預(yù)處理組細(xì)胞生長速度明顯快于高糖預(yù)處理組，細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞凸起明顯較多，且劃痕間距明顯小。劃傷后72h，兩組細(xì)胞形態(tài)差異沒有劃傷48h時(shí)明顯，但較其他觀察時(shí)間點(diǎn)劃傷邊緣處不再平整，細(xì)胞凸起要多?？傮w而言，高糖預(yù)處理對HLEB3細(xì)胞的生長具有抑制性，特別是在劃傷刺激后48h。

2.3高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)情況對高糖預(yù)處理組qRT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，對照組和劃傷組細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=59.073，P組間<0.001；F時(shí)間=35.349，P時(shí)間<0.001；F交互=11.162，P交互<0.001)。劃傷24、72h時(shí)，兩組細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-10.775、-21.266，均P<0.01)。與劃傷0h時(shí)比較，對照組劃傷后12、24、48h時(shí)細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；劃傷組劃傷后48、72h時(shí)細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1，圖3。綜上，高糖預(yù)處理HLEB3細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞Cyclin D1 mRNA的表達(dá)水平總體呈下降趨勢，而劃傷處理后24、72h其表達(dá)水平明顯上調(diào)。Western blot檢測結(jié)果顯示，高糖預(yù)處理能夠明顯抑制Cyclin D1蛋白的表達(dá)，而劃傷刺激在一定程度上可上調(diào)Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平(圖4)，與qRT-PCR檢測結(jié)果基本一致，表明高濃度葡萄糖長時(shí)間作用能夠抑制人晶狀體上皮細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)水平，而劃傷處理能夠上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)。

圖3 高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)情況 aP<0.05, bP<0.01 vs 同組0h。

2.4非高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)情況對非高糖預(yù)處理組qRT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，對照組和劃傷組細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=18.707，P<組間0.012；F時(shí)間=108.193，P時(shí)間<0.001；F交互=16.097，P交互<0.001)。劃傷48h時(shí)，兩組細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.097，P<0.001)。兩組劃傷后12、48h時(shí)細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平分別與劃傷0h時(shí)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2，圖5。綜上，未經(jīng)高糖預(yù)處理的HLEB3細(xì)胞在進(jìn)行高糖處理后，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)出不規(guī)律性，在高糖處理12、48h時(shí)其表達(dá)水平明顯上調(diào)，而劃傷處理后，細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)總體無明顯變化，但劃傷48h時(shí)其表達(dá)水平明顯上調(diào)。Western blot檢測結(jié)果(圖6)與qRT-PCR檢測結(jié)果基本一致，表明人晶狀體上皮細(xì)胞處于高糖環(huán)境下的最初一段時(shí)間，細(xì)胞對Cyclin D1的表達(dá)具有一定的自我調(diào)控能力，能夠通過調(diào)控Cyclin D1的表達(dá)從而彌補(bǔ)由于高糖環(huán)境導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量減少，而劃傷處理能夠上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)。

表2 非高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)情況

圖4 Western blot檢測高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)A: 對照組; B: 劃傷組。

圖5 非高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)情況 bP<0.01 vs 同組0h。

圖6 Western blot檢測非高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá) A: 對照組; B: 劃傷組。

3討論

糖尿病性白內(nèi)障已成為眾多糖尿病眼病并發(fā)癥中位居第二的并發(fā)癥[7]。糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制有很多，如滲透壓改變、晶狀體蛋白氧化[8]、晶狀體上皮細(xì)胞線粒體自噬[9-11]、晶狀體細(xì)胞周期變化等。有研究表明，高濃度葡萄糖處理晶狀體上皮細(xì)胞，可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂，但隨著處理時(shí)間的延長高濃度葡萄糖對細(xì)胞分裂可產(chǎn)生負(fù)面影響，從而阻止細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有絲分裂[12]。本研究中，MTT檢測結(jié)果顯示，一定濃度的葡萄糖會(huì)使晶狀體上皮細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，且葡萄糖濃度為25.5mmol/L時(shí)細(xì)胞增殖活力最大，超過該濃度細(xì)胞增殖活力下降，本研究結(jié)果與趙婷婷等[13]研究結(jié)果相符。糖尿病患者往往是在患糖尿病多年后才出現(xiàn)糖尿病性白內(nèi)障，而以往研究在研究高糖對晶狀體上皮細(xì)胞影響時(shí)并未采用高濃度葡萄糖預(yù)處理晶狀體上皮細(xì)胞來模擬糖尿病患者長期患病導(dǎo)致白內(nèi)障這一情況。故本研究設(shè)置25.5mmol/L葡萄糖預(yù)處理組和未用25.5mmol/L葡萄糖預(yù)處理組，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，高糖預(yù)處理組細(xì)胞生長速度明顯慢于非高糖預(yù)處理組，且在劃傷刺激后48h特別明顯。陳文靜等[14]研究表明低濃度的葡萄糖(5mmol/L)即可誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果提示，短暫的高濃度葡萄糖作用會(huì)增加晶狀體上皮細(xì)胞活性，但長期的高糖環(huán)境會(huì)抑制人晶狀體上皮細(xì)胞活性，這就解釋了為什么糖尿病性白內(nèi)障往往會(huì)出現(xiàn)在糖尿病中后期，而不是前期。

細(xì)胞周期受細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)的調(diào)控，其中主要起作用的是Cyclin D1和Cyclin E1。Cyclin D1主要調(diào)控節(jié)點(diǎn)是G1/S期，Cyclin D1能夠激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，從而使細(xì)胞由G1期進(jìn)入到S期，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行[15]。本研究中，qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，高糖預(yù)處理組人晶狀體上皮細(xì)胞中Cyclin D1的表達(dá)隨著處理時(shí)間延長總體呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，結(jié)果與Chang等[12]報(bào)道的高糖處理晶狀體上皮細(xì)胞對細(xì)胞分裂的影響結(jié)果基本一致。我們發(fā)現(xiàn)，劃傷處理能夠顯著刺激高糖預(yù)處理組人晶狀體上皮細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)。同樣，我們還發(fā)現(xiàn)，劃傷處理也能夠在一定程度上刺激非高糖預(yù)處理組細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)，但表現(xiàn)出不規(guī)律性，其最高表達(dá)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)在劃傷后48h，這與任潔等[16]研究發(fā)現(xiàn)高糖處理晶狀體上皮細(xì)胞后48h細(xì)胞活性最強(qiáng)結(jié)果存在一定的相似性。

綜上所述，本研究將體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞分為高糖預(yù)處理組與非高糖預(yù)處理組，同時(shí)每組內(nèi)又設(shè)置劃傷組和對照組，觀察高糖培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞在創(chuàng)傷后Cyclin D1的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)短暫的高濃度葡萄糖處理人晶狀體上皮細(xì)胞能夠增強(qiáng)細(xì)胞活性，上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，長時(shí)間的高糖環(huán)境則能夠抑制細(xì)胞活性，下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，而劃傷處理能夠刺激Cyclin D1的表達(dá)。但高糖具體如何影響Cyclin D1表達(dá)，劃傷又是以何種機(jī)制調(diào)控Cyclin D1表達(dá)，尚不清楚，故Cyclin D1能否作為治療糖尿病性白內(nèi)障的藥物靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步的探究。