小柴胡顆?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的組方配伍規(guī)律解析

畢聰，鄭如文，黃海濤，江志強，黃偉，何逸禧，張俊華，吳灝，王永剛，劉宏*，馬蓉*

(1.廣州白云山光華制藥股份有限公司，廣東 廣州 510285；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275)

小柴胡顆粒由柴胡、黃芩、甘草、黨參、半夏、生姜、大棗7味藥材組成，系廣州白云山光華制藥股份有限公司采用現(xiàn)代工藝制成的名優(yōu)中藥品種[1]，具有解表散熱，疏肝和胃之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)和臨床試驗已證明，小柴胡顆?？砂l(fā)揮抑制炎癥、調(diào)控免疫、保肝護胃的作用。作為經(jīng)典抗疫名方，小柴胡制劑被用于治療非典型性肺炎[2-3]、甲型流感[4]、登革熱等傳染性疾病，2020年被列入《廣東省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥治療方案(試行第二版)》[5]。

復(fù)方中藥具有多靶點、多途徑協(xié)同作用的特點，講究組方的辨證及藥材的配伍，其作用的本質(zhì)與組方的內(nèi)涵密切相關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)將系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)有機結(jié)合，通過構(gòu)建藥物生物靶標網(wǎng)絡(luò)，能夠整體性、多層次探尋藥物復(fù)雜體系與生物復(fù)雜系統(tǒng)的相互作用[6]，已成功應(yīng)用于中藥的靶點預(yù)測、活性成分篩選、組方科學(xué)內(nèi)涵解析[7-9]等。當(dāng)前，小柴胡顆粒的組方配伍僅局限于傳統(tǒng)方解，仍缺乏基于現(xiàn)代科學(xué)理論的解析。有鑒于此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過單成分濃度疊加、單靶點作用疊加、多靶點協(xié)同作用等方面，闡明小柴胡顆粒的組方的科學(xué)內(nèi)涵，為其現(xiàn)代化、國際化發(fā)展提供依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 活性成分篩選及交互分析 利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分析平臺檢索北柴胡、黃芩、甘草、黨參、半夏、生姜、大棗化學(xué)成分，保留“口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且化合物類藥性(drug-like，DL)≥0.18[10]”的成分；同時結(jié)合文獻補充各味藥材的藥效成分；構(gòu)建小柴胡顆?；钚猿煞謹?shù)據(jù)庫。進一步利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、Bioinformatics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析藥材間成分交互關(guān)系。

1.2 靶點篩選及交互分析 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫及參考文獻，獲取小柴胡顆粒各活性成分作用靶點。利用Venny 2.1、Bioinformatics分析藥材間靶點交互關(guān)系。

1.3 小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Perl腳本和UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)[11]將小柴胡顆粒潛在作用靶點蛋白轉(zhuǎn)化為Gene Symbol，將藥材、活性成分及作用靶點相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape 3.7.0(https://cytoscape.org//)，構(gòu)建小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。將作用靶點相應(yīng)基因?qū)氩寮?，更新?shù)據(jù)庫，種類設(shè)置為“Homo sapiens(人類)”，閾值設(shè)置P<0.05，其他參數(shù)保持默認，分別對潛在靶點進行GO(Gene Ontology)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路分析，并采用GraphPad可視化。

1.4 KEGG通路富集分析 利用Cytoscape 3.7.0“ClueGO”、“CluePedia”功能，對小柴胡顆粒及各味藥材潛在靶點進行KEGG分析，并采用GraphPad繪制各藥材富集通路熱圖。

1.5 小柴胡顆粒退熱機制分析 基于TNF信號通路，采用KEGG網(wǎng)站(https://www.kegg.jp/)Search & Color Pathway功能對小柴胡顆粒及各味藥材在通路中的相應(yīng)靶點進行標注。

2 結(jié)果與討論

2.1 小柴胡顆?；钚猿煞趾Y選 結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫和文獻，篩選得到小柴胡顆粒167個活性成分(見表1)；至少為兩種及以上藥材共有的成分有9個(見表2)，其中槲皮素、β-谷甾醇為三味藥材共有成分(見圖1)。結(jié)果表明，不同藥材在單個成分上可能會發(fā)生濃度的疊加，從而增強該成分作用；同時不同成分可相互補充，發(fā)揮多成分協(xié)同作用。

表1 小柴胡顆?；钚猿煞趾Y選

表1(續(xù))

表1(續(xù))

表1(續(xù))

表1(續(xù))

表2 小柴胡顆粒各藥材成分交集個數(shù)

圖1 藥材間成分交互韋恩圖

2.2 小柴胡顆粒作用靶點篩選 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫和參考文獻，篩選得到小柴胡顆粒268個潛在作用靶點。其中柴胡成分關(guān)聯(lián)靶點174個、黃芩77個、甘草193個、黨參83個、半夏73個、生姜45個、大棗174個，各藥材關(guān)聯(lián)靶點交集見表3。柴胡、黃芩關(guān)聯(lián)靶點韋恩圖以及黨參、半夏、生姜、大棗靶點交互韋恩圖見圖2。結(jié)果表明，小柴胡顆?？赡芡ㄟ^單靶點疊加作用和多靶點協(xié)同作用發(fā)揮療效[12]。在單靶點疊加作用方面，小柴胡顆粒各味藥材靶點間存在著明顯的交集，不同藥材的成分可作用于同一靶點，發(fā)揮“集團軍”作用。這些活性成分可能通過相繼與靶點結(jié)合，發(fā)生濃度、時間上的疊加，從而增強藥效和時效性。在多靶點協(xié)同作用方面，小柴胡顆粒各味藥材可通過多個靶點、通路，在不同的功能模塊中產(chǎn)生協(xié)同性、整合性作用[13]。

圖2 君臣藥間、佐藥間靶點交互韋恩圖

表3 小柴胡顆粒各藥材靶點交集個數(shù)

2.3 小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將小柴胡顆粒7味藥材、167個活性成分、268個潛在作用靶點導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。其中綠色為藥材，粉紅色為活性成分，藍色為作用靶點。

圖3 小柴胡顆粒藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 KEGG通路分析 268個潛在作用靶點共富集得到275條作用通路，其中靶點數(shù)大于10的作用通路121條。富集靶點數(shù)排名前二十條作用通路包括pathways in cancer、metabolic pathways、human cytomegalovirus infection、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等(見圖4)，與抗病毒、炎癥、免疫、代謝等方面相關(guān)。將各味藥材的作用靶點富集到通路繪制熱圖(見圖5)，顏色越深表明該藥材在該通路富集的靶點個數(shù)越多。

圖4 小柴胡顆粒KEGG通路圖(前20條)

小柴胡顆粒中，柴胡為君藥，是常用解表藥，透泄少陽之邪、疏泄氣機之瘀滯，具有和解表里，疏肝升陽之功效，在方中起主要的治療作用。柴胡與小柴胡顆粒整體富集的通路相近，主要包括抗病毒-卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、甲型流感(influenza A)等；肝炎-乙型肝炎(hepatitis B)、丙型肝炎(hepatitis C)等；心血管-血液流變及動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)等；免疫炎癥絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)、白介素-17(IL-17)等信號通路。

黃芩為臣藥，苦寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，可用于治療溫?zé)岵?、上呼吸道感染、肺熱咳嗽等，在方中可輔助柴胡治療主證及兼證。黃芩富集的通路主要包括人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、人類免疫缺陷病毒1感染(human immunodeficiency virus 1 infection)等自身免疫、病毒感染相關(guān)通路；麻疹(Measles)等呼吸道傳染病相關(guān)通路；絲裂原活化蛋白激酶(PI3K-AKT、MAPK)等炎癥相關(guān)通路；沙門氏菌感染(Salmonella infection)、致病性大腸桿菌感染(PathogenicEscherichiacoliinfection)等細菌感染相關(guān)通路。表明黃芩在加強君藥柴胡對免疫、抗炎、抗病毒作用的同時，還增加了處方的抗菌作用。已有報道證實，黃芩能夠抑制大腸埃希菌[14]、葡萄球菌[15-16]、沙門氏菌[17]等細菌，以及念珠菌[18]等真菌。

黨參、半夏、生姜、大棗為佐藥，除作用于抗病毒、抗腫瘤等“主證”相關(guān)通路外，還可分別作用于不同“兼證”相關(guān)通路。黨參補中益氣、健脾益肺、養(yǎng)血生津，作用于內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、松弛素(relaxin signaling pathway)等通路，其中松弛素可通過舒張血管保護心臟免于缺血引起的損傷[19]，也可通過一氧化氮調(diào)控消化道平滑肌，影響胃腸道運動[20]，還可保護肺免受缺血-再灌注損的保護[21]。研究表明，黨參對消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)均有顯著調(diào)節(jié)作用[22]。大棗補中益氣、養(yǎng)血安神，主要作用通路為fluid shear stress and atherosclerosis等心血管相關(guān)通路。在本方中，黨參與大棗合用可發(fā)揮益氣健脾、養(yǎng)血生津的功效。脾主要功能包括胃腸道消化吸收和肝臟內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化及能量生成[23]，“養(yǎng)血生津”與血管內(nèi)皮功能、血液流變、造血因子增殖、唾液分泌等有關(guān)，上述通路富集結(jié)果與傳統(tǒng)中醫(yī)理論相契合。半夏主要作用于神經(jīng)活性、激素分泌、代謝相關(guān)通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、代謝通路(metabolic pathways)、環(huán)磷酸腺苷信號通路(cAMP signaling pathway)等，可能與半夏治療咳嗽、嘔吐、暈眩、抑郁癥功能相關(guān)。研究表明，大鼠嘔吐時迷走神經(jīng)胃支傳出活動減弱，半夏可激活該活動起到止嘔作用[24]。生姜除作用于神經(jīng)活性、內(nèi)分泌通路外，還包括膽堿能突觸(cholinergic synapse)、5-羥色胺能突觸(serotonergic synapse)等神經(jīng)傳導(dǎo)通路及甲狀腺激素信號途徑(thyroid hormone signaling pathway)等激素相關(guān)通路。膽堿能突觸是以乙酰膽堿為傳遞介質(zhì)的突觸，而乙酰膽堿可影響胃腸道平滑肌興奮、支氣管收縮、心臟節(jié)律等生理功能。5-羥色胺則可調(diào)節(jié)肺血管平滑肌及肺循環(huán)[25]、參與腸道運動、肝生成[26]等，與止嘔功效密切相關(guān)[27]。中醫(yī)理論認為，半夏、生姜合用可和胃降逆止嘔，其機制可能與調(diào)控神經(jīng)活性、神經(jīng)傳導(dǎo)、激素分泌相關(guān)。

甘草為使藥，《本草綱目》稱之為“國老”，可調(diào)和諸藥，緩解藥物毒性、烈性，常見于抗疫和治療咳嗽方劑。研究發(fā)現(xiàn)，甘草可調(diào)節(jié)P-gp轉(zhuǎn)運蛋白[28]、P450代謝酶[29]等，影響藥物的吸收、分布、代謝、排泄，實現(xiàn)調(diào)和諸藥之功效。本研究中，甘草198個靶點共富集于266條通路，涉及代謝、抗病毒、抗腫瘤、免疫炎癥等多個方面，一方面可加強君、臣藥作用，另一方面可調(diào)節(jié)藥物配伍的代謝和分布，引諸藥直達病所。

2.5 退熱機制及配伍規(guī)律解析 解表散熱為小柴胡顆粒的主效應(yīng)[30]，有必要進一步闡釋其退熱機制及配伍規(guī)律。病毒、細菌等發(fā)熱激活物進入體內(nèi)后，可激活產(chǎn)致熱原細胞，促使其釋放IL-1、TNF、IFN、MIP-1、IL-6等內(nèi)生致熱原，誘導(dǎo)體溫調(diào)節(jié)中樞釋放PGE2、cAMP等發(fā)熱介質(zhì)，導(dǎo)致調(diào)節(jié)性體溫升高，從而引起機體各組織器官功能和物質(zhì)改變。前期工作發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路為小柴胡顆粒的關(guān)鍵作用通路，該通路參與調(diào)控細胞存活、凋亡和分化，與抗病毒、炎癥、免疫等生物學(xué)功能密切相關(guān)[31]，參與機體發(fā)熱病程[32]。小柴胡顆粒各味藥材的靶點標記情況見圖6，靶點顏色深淺代表作用藥材數(shù)量多少，靶點下方柱形顏色代表作用藥材種類。

圖6 小柴胡顆粒各藥材在TNF信號通路中的作用靶點圖

小柴胡顆粒7味藥材共富集得到TNF信號通路中27個靶點，其中全部7種藥材共同作用的核心靶點有5個：核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白1(AP-1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、胱天蛋白酶3(CASP3)。NF-κB是對有害細胞刺激的第一反應(yīng)者，可激活多種細胞因子，參與抗病毒、炎癥反應(yīng)等生理過程[33-34]；AP-1為JUN、FOS復(fù)合體，影響細胞分化增殖，參與免疫、外界刺激應(yīng)激等，可調(diào)控促炎因子表達[35]；PTGS2，即COX-2，是發(fā)熱介質(zhì)PGE2合成的主要限速酶，直接參與了發(fā)熱、疼痛、炎癥反應(yīng)[36]；MMP9參與細胞重構(gòu)、組織修復(fù)，可通過降解細胞外基質(zhì)和基底膜，調(diào)控細胞因子及趨化因子的活性，促進病毒擴散并參與病毒感染引起的免疫反應(yīng)[37]，與發(fā)熱、咳嗽、肺炎病程相關(guān)；CASP3參與細胞凋亡，影響病毒擴散、增殖與組織修復(fù)[38]。全部7味藥材可共同作用于上述5個核心靶點，從凋亡、炎癥、免疫、發(fā)熱介質(zhì)多靶點多層面發(fā)揮退熱功效。

在藥材配伍方面，君藥柴胡與絕大部分靶點密切相關(guān)(24個)，發(fā)揮主導(dǎo)作用；臣藥黃芩除5個核心靶點外，還作用于白細胞趨化因子CCL2、促炎因子IL-6等，增強了柴胡在調(diào)控免疫、抑制炎癥、退熱方面的作用；佐藥生姜、半夏、大棗、黨參合用，加強了柴胡在炎癥因子、趨化因子、PTGS2等方面的作用，有助于縮短病程；使藥甘草參與26個靶點相關(guān)，可能起到調(diào)和諸藥的作用。由此可知，小柴胡顆粒7味藥材通過組方配伍，能夠提高機體免疫力、抑制炎癥、調(diào)節(jié)體溫，加速病原體清除，縮短咳嗽、發(fā)熱病程。

小柴胡顆粒發(fā)揮退熱療效的潛在機制如下：(1)調(diào)節(jié)TNF信號通路上游基因：①作用于IKK α和β催化亞基，調(diào)節(jié)NF-κB激活狀態(tài)，NF-κB進一步調(diào)控細胞凋亡、炎癥一系列活動；②通過JNK、p38、ERK 3個途徑調(diào)節(jié)MAPK通路；③作用于AP-1復(fù)合物，調(diào)控機體應(yīng)對外界刺激時的細胞進程；④作用于CASP家族，參與細胞凋亡。(2)調(diào)節(jié)TNF信號通路下游基因：①作用于促炎趨化因子，影響白細胞趨化及活性、病原體吞噬等免疫過程；②作用于內(nèi)生致熱原，IL-1和IL-6、IFN-γ，直接調(diào)控發(fā)熱介質(zhì)釋放；③作用于基質(zhì)金屬蛋白酶，參與細胞重構(gòu)、組織修復(fù)；④作用于細胞黏附因子，參與免疫細胞的黏附和遷移；⑤作用于產(chǎn)生發(fā)熱介質(zhì)的關(guān)鍵酶PTGS2，直接參與體溫調(diào)控。

3 小結(jié)及展望

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過單成分濃度疊加、單靶點作用疊加、多靶點協(xié)同作用等方面，科學(xué)解析了小柴胡顆粒的組方配伍規(guī)律。君藥柴胡發(fā)揮主導(dǎo)地位，作用于抗病毒、退熱、免疫、炎癥等相關(guān)通路及靶點；臣藥黃芩可加強柴胡作用，同時增加抗菌功效；佐藥黨參、大棗通過作用于內(nèi)分泌、松弛素、心血管相關(guān)通路及靶點，影響胃腸道、肝臟、血管內(nèi)皮功能，發(fā)揮益氣健脾，養(yǎng)血生津的功效；佐藥半夏、生姜通過控神經(jīng)活性、神經(jīng)傳導(dǎo)、激素分泌，發(fā)揮和胃降逆止嘔、抗抑郁的功效；使藥甘草具有調(diào)和諸藥的作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)小柴胡顆粒7味藥材共同作用的5個核心靶點，對其退熱療效及藥材配伍具有重要作用。本研究為小柴胡顆?？茖W(xué)內(nèi)涵的挖掘提供了依據(jù)，為后續(xù)作用機制與靶點的確證提供了參考。