阿西替尼對結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖、凋亡及自噬的影響研究

潘晟, 梅文超, 黃林飛, 夏甘霖, 陶艷娥, 徐競, 李俊

結(jié)腸癌(colon cancer,CC)的發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤中第3位和第2位,嚴(yán)重威脅人類健康[1]。目前,在結(jié)腸癌臨床綜合治療中,手術(shù)切除仍是主要治療手段,但有近30%患者不適合手術(shù)治療,輔助化療價格昂貴,且易產(chǎn)生毒性及耐藥性,患者接受度低,因此亟需尋找低毒廉價且有效的藥物治療方法[2-3]。阿西替尼(axitinib,AXI)是第2代血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)抑制劑,可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡,抑制結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤組織新生血管形成及降低腫瘤細胞活力,且可延長腎細胞癌晚期患者生存期[4-6],但關(guān)于AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞生物學(xué)活性的影響的研究尚鮮有報道。因此,本研究旨在探究AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞自噬、增殖及凋亡的影響,為結(jié)腸癌的靶向治療提供新思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器

人結(jié)腸癌HCT-116細胞購自美國ATCC(貨號:ATCC-Y2775); AXI購自上海土鋒生物科技有限公司(貨號:EB02451)。RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號:21870084)、胎牛血清(fetal boeuf serum,FBS,貨號:10099141)均購自美國Gibco;噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(貨號:11465007001)、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(貨號:APOAF)購自美國Sigma。鼠源一抗Cyclin D1(貨號:33-3500)、β-actin抗體(貨號:MA5-15739)、Bcl-2(貨號:13-8800)、Bax(貨號:MA5-13994)、兔源beclin1(貨號:PA5-86091)、LC3 Ⅱ (貨號:PA5-86089)、mTOR(貨號:PA5-34663)、p-mTOR(貨號:44-1125G)、cleaved-Caspase3(貨號:700182)、c-Myc(貨號:700648)、二抗羊抗兔、羊抗鼠IgG羊抗兔IgG(貨號:15135,B-2752)均購自美國Invitrogen;兔源P70S6K(貨號:AP0564)、p-P70S6K(貨號:RK06000)均購自中國ABclone;CO2培養(yǎng)箱(美國,Thermo Fisher)、IX73熒光顯微鏡(日本,奧林巴斯)等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 常規(guī)復(fù)蘇人結(jié)腸癌HCT-116細胞,鋪板于含10% FBS、1% 青鏈霉素RPMI 1640細胞生長培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時用0.25%胰蛋白酶消化。分別設(shè)為AXI 1組(15.0 μmol/L)、AXI 2組(30.0 μmol/L)、AXI 3組(60.0 μmol/L)及無任何添加的正常對照組(NC組),每組6個重復(fù)。

1.2.2 MTT檢測結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖情況 分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后收集各組細胞，用MTT試劑盒檢測各孔細胞增殖情況,具體操作嚴(yán)格按照說明書進行。細胞增殖抑制率=(1-ODAXI組/ODNC組)×100%。

1.2.3 AnnexinV-FITC/PI法檢測結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡情況 收集各組細胞,采用AnnexinV-FITC/PI法于流式細胞儀檢測結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡情況,操作參照試劑盒說明書,計算細胞凋亡率。

1.2.4 WB檢測結(jié)腸癌HCT-116細胞中自噬、增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達 采用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白,測定蛋白濃度后,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品采用6% SDS-PAGE膠進行電泳,濕轉(zhuǎn)法將膠上蛋白轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h,采用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋,添加一抗(LC3 Ⅱ 1∶500;beclin1 1∶500;mTOR 1∶500;p-mTOR 1∶1 000;P70S6K 1∶200;p-P70S6K 1∶200;CyclinD1 1∶500、c-Myc 1∶500;Bcl-2抗體 1∶500;Bax抗體 1∶500;cleaved-Caspase3抗體 0.1～0.2 μg/ml;β-actin抗體 1∶500)4 ℃孵育過夜,TBST 緩沖液洗膜 3次,每次20 min,用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育1.5 h,洗膜、顯色、曝片,觀察并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖的影響

與NC組比較,15.0 μmol/L、30.0 μmol/L的AXI抑制結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖作用呈濃度依賴性及時間依賴性增加(P<0.05),同一培養(yǎng)時間,AXI 2組和AXI 3組結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖抑制率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 不同濃度AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞增值的影響

2.2 AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡的影響

與NC組比較,AXI 1組和AXI 2組結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡率依次增加(P<0.05),AXI 2組和AXI 3組結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖1、表2。

圖1 不同濃度AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡的影響

表2 不同濃度AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡的影響

與NC組比較,AXI 1組和AXI 2組結(jié)腸癌HCT-116細胞LC3 Ⅱ、beclin1蛋白表達水平依次增加(P<0.05),AXI 2組和AXI 3組結(jié)腸癌HCT-116細胞LC3 Ⅱ、beclin1蛋白表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2、表3。

圖2 AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞LC3 Ⅱ、beclin1蛋白表達的影響

表3 AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞LC3 Ⅱ、beclin1蛋白表達的影響

與NC組比較,AXI 1組和AXI 2組結(jié)腸癌HCT-116細胞p-mTOR、p-P70S6K蛋白表達水平依次減少(P<0.05),AXI 2組和AXI 3組結(jié)腸癌HCT-116細胞p-mTOR、p-P70S6K蛋白表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖3、表4。

圖3 AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞mTOR通路活性的影響

表4 AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞mTOR通路活性的影響

2.5 AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

與NC組比較,AXI 1組和AXI 2組結(jié)腸癌HCT-116細胞Cyclin D1、c-Myc、Bcl-2蛋白表達水平依次減少(P<0.05),Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平依次增加(P<0.05),AXI 2組和AXI 3組結(jié)腸癌HCT-116細胞Cyclin D1、c-Myc、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見圖4、表5。

圖4 AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

AXI是一種多靶點絡(luò)氨酸激酶抑制劑,可與VEGFR 1、2、3絡(luò)氨酸激酶深部ATP位點結(jié)合,抑制內(nèi)皮細胞對胞外基質(zhì)蛋白的黏附與遷移,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡,抑制腫瘤新生血管形成及細胞存活率[7-8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AXI可成濃度和時間依賴性抑制結(jié)腸癌HCT116細胞增殖及Cyclin D1、c-Myc蛋白表達,Cyclin D1是G1期細胞增殖關(guān)鍵蛋白,c-Myc是一種調(diào)節(jié)基因,在腫瘤細胞中高表達,二者均可促進細胞增殖,與樊艷等[9]在乳腺癌中的研究結(jié)果一致,提示AXI可能通過下調(diào)c-Myc、Cyclin D1蛋白表達,抑制結(jié)腸癌HCT116細胞增殖。

誘導(dǎo)細胞凋亡是抗腫瘤分子機制研究中重要途徑之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,AXI可促進細胞凋亡,降低Bcl-2蛋白表達,增加Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白,定位于線粒體外膜,可促進細胞存活抑制細胞凋亡。Bax與Bcl-2均屬于Bcl-2家族,但作用相反,Bax屬于促凋亡蛋白,可與Bcl-2形成異二聚體,對Bcl-2產(chǎn)生抑制作用[10-11]。半光氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinylaspartate special protein,Caspace)主要以酶原(uncleaved)形式廣泛存在于細胞中,其中cleaved-Caspace3、cleaved-Caspace3、cleaved-Caspace8、cleaved-Caspace9等在細胞凋亡中起決定性作用,是細胞凋亡通路的經(jīng)典檢測指標(biāo)。Bcl-2蛋白減少,Bax蛋白增加導(dǎo)致,Bax/Bcl-2比例增加,表現(xiàn)為促凋亡作用,進而激活細胞內(nèi)Caspase3凋亡途徑,與Wu等[12]研究結(jié)果一致,提示AXI可能通過上調(diào)Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達,下調(diào)Bcl-2蛋白表達促進結(jié)腸癌HCT-116細胞凋亡。

自噬在機體生理和病理過程中均可發(fā)生,又被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡過程,其中自噬體的形成是關(guān)鍵,適度自噬可實現(xiàn)細胞本身代謝的需要或細胞器更新,然而過度自噬可誘導(dǎo)細胞死亡,但自噬對腫瘤起正面還是負面作用尚不明確[13-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,AXI增加結(jié)腸癌HCT-116細胞中LC3 Ⅱ、beclin1蛋白表達水平,降低p-mTOR、p-P70S6K蛋白表達水平。微管相關(guān)蛋白1A和1B(Microtubule-associated proteins 1A/1B-light chain 3,LC3)和beclin1是標(biāo)志性自噬蛋白,LC3 Ⅰ轉(zhuǎn)型為LC3 Ⅱ形成標(biāo)志自噬形成,而雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路與自噬活性密切相關(guān),自噬激活依賴于mTOR抑制[16-17],與孟春芹、呂艷偉等[18-19]研究報道一致。提示AXI可能通過下調(diào)mTOR及其下游P70S6K蛋白磷酸化水平抑制mTOR信號通路激活,促進LC3 Ⅱ、beclin1蛋白表達，誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細胞自噬,抑制其增殖,促進其凋亡。

綜上所述,AXI可能通過抑制mTOR通路激活,誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細胞自噬,抑制其增殖,促進其凋亡。本研究首次探究AXI對結(jié)腸癌HCT-116細胞生物學(xué)活性的影響并初步揭示其作用機制,為AXI靶向治療結(jié)腸癌提供新的理論參考。但AXI是否通過阻滯結(jié)腸癌HCT-116細胞周期抑制其增殖,及在結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖、凋亡、自噬作用過程中涉及的其他通路尚不明確,有待進一步深入探究。