貴州小麥品種(系)中慢銹基因Lr34/Yr18的分子檢測(cè)

楊雪敏，任明見，李魯華，徐如宏

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025； 2.國家小麥改良中心貴州分中心，貴陽 550025)

我國是小麥生產(chǎn)大國之一，每年小麥種植面積在2 400萬hm2左右[1]。在我國大部分地區(qū)都會(huì)發(fā)生小麥銹病，據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心統(tǒng)計(jì)[2]，2019年小麥條銹病在江漢平原、漢水流域、西南和西北部分麥區(qū)中等發(fā)生，局部偏重，全國發(fā)生面積200萬hm2。貴州由于其獨(dú)特的氣候和地理?xiàng)l件，也非常適合小麥銹菌的流行和危害，導(dǎo)致小麥銹病連年發(fā)生[3]。同時(shí)，由于條銹菌致病性變異頻繁，2019年春季西南麥區(qū)條銹菌新致病類群貴農(nóng)22不斷上升為優(yōu)勢(shì)種群，小麥品種抗性喪失[2]。因此，目前對(duì)小麥生產(chǎn)品種抗銹性提出了更高要求。研究表明，培育、推廣抗病小麥品種一直是最為經(jīng)濟(jì)有效且綠色環(huán)保的防控措施[4]。特別是培育慢病性品種是培育抗性持久，減少病害突然爆發(fā)、大面積流行隱患的重要手段[5]。近年來，慢銹病抗性基因的研究和利用越來越受重視，培育慢銹品種成為國際小麥抗病育種的主流方向[6]。例如，國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)育成一大批慢銹品種，并在世界各地推廣，攜帶Lr34/Yr18的小麥品種在印度和巴基斯坦等發(fā)展中國家廣泛種植[7]；在澳大利亞也已將慢銹基因Lr34/Yr18及其緊密連鎖的分子標(biāo)記csLV 34 成功應(yīng)用于小麥育種[6]。

小麥慢條銹病(Pucciniastriiformisf. sp. tritici)這一概念由Zadoks[8]首次提出，其發(fā)現(xiàn)有些含有主效基因的小麥品種在抗性被條銹菌克服后，仍然具有微弱抗性。小麥的慢銹病基因中，Lr34/Yr18基因較早在小麥生產(chǎn)中得到了應(yīng)用[9]。Dyck等[10]最早報(bào)道了Yr18和Lr34的抗性水平，并將其定位于7 D上；后來許多學(xué)者利用QTL分析技術(shù)將該位點(diǎn)定位在小麥7 DS染色體上[11-15]。Lr34最初可能來源于巴西的農(nóng)家種Alfredo Chaves或?yàn)趵绲霓r(nóng)家種選系A(chǔ)mericano 44 D[12]。Krattinger[16]利用圖位克隆法獲得了Lr34基因的全長序列，并證實(shí)了Yr18/Lr34這2種病害由同一基因位點(diǎn)所控制。Lr34/Yr18基因具有良好慢銹性，一般在苗期呈感病而在成株期表現(xiàn)抗性，它與稈銹(Sr34) 、葉銹(Lr34) 、白粉(Pm38)等多個(gè)抗性基因連鎖[12,17]，屬“一因多效”的優(yōu)良基因[18,19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Lr34/Yr18基因位點(diǎn)與葉尖壞死基因Ltn1、抗小麥黃矮病基因Btv1緊密連鎖[19,20]。同時(shí)，Hua Chen等研究表明，含有Lr34/Yr18基因的葉銹和條銹的侵染率明顯低于不含有Lr34/Yr18的品種，其結(jié)合3～4個(gè)微效基因可以在環(huán)境中提高葉銹和條銹的抗性[22]。

為了方便開展Lr34/Yr18基因的分子輔助選擇，Lagudah[22]和Yuan等[23]以EST得到的克隆作為探針進(jìn)行RFLP分析，找到了一個(gè)能清晰區(qū)分含有和不含Lr34/Yr18的RFLP標(biāo)記，后開發(fā)了功能標(biāo)記csLV 34。許多學(xué)者利用csLV 34標(biāo)記鑒別小麥品種中是否攜帶Lr34/Yr18基因，證明該標(biāo)記是一個(gè)重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高的分子標(biāo)記，可用于小麥Lr34/Yr18基因的鑒定與選擇[6,24-30]。貴州處于云貴高原，銹病常年流行，在小麥品種中導(dǎo)入Yr18/Lr34基因有利于提高葉銹和條銹抗性，對(duì)于兼抗和持久抗性品種的選育也具有重要意義。但貴州小麥中開展慢銹性研究和慢銹抗病品種選育的報(bào)道較少，僅見梁傳靜等[31]對(duì)貴州種植的115個(gè)小麥品種資源進(jìn)行慢銹性品種鑒定，初步篩選出26個(gè)可能具有慢銹抗性品種，但這些材料是否含有Lr34/Yr18基因沒有進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。本研究利用STS標(biāo)記csLV 34對(duì)258份貴州小麥品種(系) 進(jìn)行分子檢測(cè)，以了解慢銹病基因Lr34/Yr18在這些小麥品種(系)中的分布，同時(shí)篩選含有慢銹基因的優(yōu)良小麥種質(zhì)資源，為貴州慢銹抗性小麥新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥材料258份，由國家小麥改良中心貴州分中心收集和保存，詳見表1。

續(xù)表1：

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取

每份材料隨機(jī)取10粒種子發(fā)芽, 采用植物基因組DNA提取試劑盒(購自天根公司www.tiangen.com)的方法提取DNA。分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，并稀釋到50 ng·L-1作為模板DNA備用。

1.2.2STS標(biāo)記檢測(cè)

根據(jù)Lagudah等[32]開發(fā)的特異性STS標(biāo)記csLV 34檢測(cè)Lr34/Yr18基因，上游引物序列為5′-GTTGGTTAAGACTGGTGATGG-3′，下游引物序列為5′-TGCTTGCTATTGCTGAATAGT-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。參照Lagudah等[32]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL，總體積中含有20 mmol·L-1Tris-HCl(pH=8.4)、20 mmol·L-1KCl、0.2 mmol·L-1dNTPs、1.5 mmol·L-1MgCl2，每條引物10 pmol，TaqDNA 聚合酶1 U，模板DNA 100 ng。PCR反應(yīng)體系為94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3毛細(xì)管電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(美國AATI, Fragment AnalyzerTM)進(jìn)行檢測(cè)。使用的905-33-DNA-0～500 bp.mthds試劑盒購于Analogic Tech(www.aati-us.com)。使用24μL體系：2μL PCR擴(kuò)增物+22μL Buffer TE。檢測(cè)程序：預(yù)運(yùn)行電壓和時(shí)間為6 kV，30 s；Marker進(jìn)樣電壓和時(shí)間為5 kV，10 s；樣品進(jìn)樣電壓和時(shí)間分別為5 kV和10 s；分離時(shí)電壓和時(shí)間為6 kV和45 min。

圖1 標(biāo)記csLV 34對(duì)貴農(nóng)10-3-16-7擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳譜帶圖

圖2 標(biāo)記csLV 34對(duì)貴農(nóng)31擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳譜帶圖

圖3 標(biāo)記csLV 34對(duì)貴農(nóng)08-9擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳譜帶圖

2 結(jié)果與分析

2.1 STS標(biāo)記csLV 34的鑒定結(jié)果

在本研究中，采用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)對(duì)STS標(biāo)

記csLV 34的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)。根據(jù)Lagudah等[32]的研究，STS標(biāo)記csLV 34主要擴(kuò)增得到2個(gè)DNA片段，其中只有擴(kuò)增出150 bp片段的材料可能含有Lr34/Yr18，而擴(kuò)增出229 bp或其它片段的材料不含Lr34/Yr18。從本研究檢測(cè)結(jié)果看，毛細(xì)管電泳譜帶清晰易讀，可根據(jù)擴(kuò)增片段分子量直接判斷目標(biāo)片段有無。STS標(biāo)記csLV 34在258份材料中主要擴(kuò)增出150 bp(圖1)、229 bp(圖2)、236 bp(圖3)等特異片段，與前人研究結(jié)果基本一致。Kolmer等研究發(fā)現(xiàn)，STS標(biāo)記csLV 34的擴(kuò)增產(chǎn)物中除了229 bp片段以外，還有一個(gè)比229 bp約大50 bp的片段，但該片段與Lr34/Yr18無關(guān)[33]。本研究中也發(fā)現(xiàn)了相似擴(kuò)增片段，其大小為266 bp，與目標(biāo)片段229 bp相差37 bp(見圖2)。

2.2 小麥品種(系)中Lr34/Yr18基因的檢測(cè)結(jié)果

利用STS標(biāo)記csLV 34對(duì)258份小麥材料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1。有5個(gè)小麥材料檢測(cè)到150 bp的特異片段，分別是張10選42，紫R 3-2-2-3，黔09197，貴農(nóng)10-3-16-7和貴農(nóng)19，表明這5個(gè)小麥材料可能含有Lr34/Yr18基因，占供試材料的1.9%。其余材料中，擴(kuò)增片段大小為229 bp的有61份，占23.6%；236 bp的有105份，占40.7%；還有167 bp、 263 bp及其它不同帶型的占33.8%，這些材料中都沒檢測(cè)到150 bp的特異片段，表明其可能不含Lr34/Yr18基因。

3 討 論

有研究報(bào)道，中國小麥品種(系)中含有Lr34/Yr18基因頻率極低，主要原因是過去在品種選育中過分強(qiáng)調(diào)高抗或免疫的主效基因的選擇，忽視了慢病基因的利用[6,34]。國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)加大慢病性基因Yr18/Lr34的利用研究，在其小麥品種中慢銹基因Yr18/Lr34分布頻率較高，達(dá)21.7%[34]。本研究中，258份小麥材料中僅檢測(cè)到5份含有Lr34/Yr18基因，占供試材料的1.9%，相對(duì)于楊文雄等[6]的研究，本研究中Lr34/Yr18基因分布頻率較低，而與張玉薇等[35]的研究結(jié)果相近，說明在貴州小麥品種(系)中含有Lr34/Yr18基因的材料較少，在過去的小麥育種中對(duì)慢銹抗性基因的利用研究重視不夠，今后應(yīng)加大Lr34/Yr18等慢銹抗性基因的利用，有針對(duì)性地培育持久抗病品種。同時(shí)，據(jù)楊文雄等[6]的研究表明，中國小麥品種(系)中農(nóng)家品種攜帶Lr34/Yr18基因的比例較高，達(dá)到85.1%，因而在貴州小麥地方品種和農(nóng)家品種中也可能含有較多的慢銹病抗源，在以后應(yīng)加強(qiáng)地方品種和農(nóng)家品種的收集、鑒定和利用研究，擴(kuò)大慢銹病基因的種質(zhì)來源。

貴州銹病常年流行，開展慢銹病育種和品種合理布局對(duì)控制銹病流行和生理小種變化具有重要意義。但是在對(duì)Lr34/Yr18基因的應(yīng)用過程中，Kolmer等[33]認(rèn)為，Lr34/Yr18基因的抗性主要在成株期表達(dá)，容易被其他主效基因的影響所掩蓋，而且受不同品種背景和其他基因的影響，會(huì)導(dǎo)致鑒定的不準(zhǔn)確。所以在實(shí)際工作中，開展小麥慢銹病抗性鑒定，需要在室內(nèi)條件下進(jìn)行分小種接種測(cè)定才能取得準(zhǔn)確結(jié)果，這為開展小麥慢銹病育種和品種選育增加了難度。另外，在進(jìn)行大群體的分子輔助選擇過程中，由于不能準(zhǔn)確鑒定慢銹抗性植株會(huì)降低育種的選擇效率。已有研究結(jié)果已驗(yàn)證了STS標(biāo)記csLV 34的有效性，則可在小麥慢銹抗病育種中利用此標(biāo)記開展分子輔助選擇，從而提高育種選擇效率。

本研究對(duì)258份小麥品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5份可能含有Lr34/Yr18基因，分別是張10選42，紫R 3-2-2-3，黔09197，貴農(nóng)10-3-16-7和貴農(nóng)19。在彭昕等[36]的研究中，貴農(nóng)19并沒有檢測(cè)到csLV 34標(biāo)記特異片段，可能是和本研究用到的材料名稱相同但遺傳組成不同。在本研究中貴農(nóng)19-1品系也沒有檢測(cè)到，說明在相同原始親本的后代品系中可能會(huì)出現(xiàn)不同類型，不同來源品系可能含有不同的抗性基因。對(duì)于篩選出的這5個(gè)可能含有Lr34/Yr18基因的小麥品系，可以直接作為慢銹病抗性育種和遺傳改良的親本材料應(yīng)用于小麥育種中，也可與更多抗病基因聚合選育兼抗和持久抗性品種，從而提高貴州小麥抗病育種的水平和促進(jìn)小麥生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。