紅山櫻新品種粉彩組培快繁技術(shù)研究

張蕾蕾，奉樹成，王賢榮

(1.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210000； 2.上海植物園，上海 200231)

粉彩(Fencai)為優(yōu)良鄉(xiāng)土植物紅山櫻(Cerasusjamasakura)種系下的新品種，具有花期早、花色艷麗、花徑大、抗性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，在園林應(yīng)用、行道樹及庭院美化方面，擁有極大的市場前景和推廣應(yīng)用價(jià)值。但由于其傳統(tǒng)的繁殖方法周期長，結(jié)實(shí)率低且幼果易脫落等因素的影響，導(dǎo)致粉彩的規(guī)?；a(chǎn)受到嚴(yán)重限制，極大阻礙了其市場的發(fā)展，運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)來完善其繁殖體系尤為關(guān)鍵。

近年來，很多學(xué)者對(duì)櫻花進(jìn)行大量研究，櫻屬植物組織培養(yǎng)快速繁殖體系均有建立[1-4]。櫻屬組織培養(yǎng)多以離體器官直接誘導(dǎo)成苗方式進(jìn)行，Paprstein F.等[5]以2個(gè)甜櫻桃品種的莖尖為外植體，在離體條件下直接產(chǎn)生新植株；佐々木揚(yáng)[6]使用野櫻桃芽腋研究了日本傳統(tǒng)手工業(yè)的3種優(yōu)良野生無性系繁殖成本；及華[7]以山櫻花品種敬翁櫻的嫩梢和帶腋芽的莖段為材料，獲得完整植株，移栽成活率達(dá)90%；Negishi K等[8]進(jìn)行東京櫻花(Cerasusyedoensis(Matsum.) Yu et Li)組培時(shí)，通過添加激素6-BA、GA3、IBA可直接誘導(dǎo)芽原基產(chǎn)生新植株。盡管直接誘導(dǎo)莖尖或腋芽再生植株可行有效，但該法的增殖系數(shù)低且易受取材季節(jié)和天氣限制，因此提高叢生不定芽增殖系數(shù)對(duì)于短期內(nèi)獲得大量芽苗并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)極為重要。本研究以紅山櫻新品種粉彩幼莖為材料，采用全組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)法研究不同培養(yǎng)基和激素組配對(duì)粉彩再生的影響，為規(guī)?；N植和生產(chǎn)粉彩良木提供理論依據(jù)。粉彩作為新品種，有關(guān)組培快繁體系的研究未見報(bào)道，以粉彩的幼嫩莖段為外植體，采用全組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)粉彩組培的影響，初步建立粉彩的組培體系，為規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為紅山櫻種系下新品種粉彩三年生種苗，取自南京林業(yè)大學(xué)櫻花研究基地。3月—5月晴朗天氣，選擇生長健壯、無病蟲害的幼嫩莖段。

1.2 方 法

1.2.1試驗(yàn)材料處理與消毒

將采集的幼嫩莖段進(jìn)行修整，剪成1.5～2.0 cm的帶腋芽小段，將修整好的小段放在洗滌劑中浸泡并攪拌，之后將洗滌后的材料分別用流水沖洗0、30、60、90 min，再轉(zhuǎn)入無菌操作臺(tái)進(jìn)一步操作。用70%～75%乙醇浸泡25～30 s，無菌水清洗3～5次，重復(fù)3次，再用0.1%的HgCl2分別消毒處理3、5、7、10 min，無菌水清洗3～5次，過程中不斷搖晃，使其徹底消毒。

1.2.2誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基篩選

愈傷組織誘導(dǎo)啟動(dòng)培養(yǎng)基采用1/4 MS[9]作為基本培養(yǎng)基，以6-BA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、IBA(0.01、0.02、0.03 mg·L-1)激素組合，采用全組合進(jìn)行試驗(yàn)(見表2)，于黑暗中培養(yǎng)。通過觀察愈傷組織生長情況，分析不同激素濃度和激素組合對(duì)粉彩愈傷組織誘導(dǎo)的影響，從而篩選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并挑選健壯的愈傷組織進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

出愈率(%)=(出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

有效愈傷率(%)=(可用于分化愈傷數(shù)/出愈外植體數(shù))×100%。

1.2.3愈傷組織分化叢生芽培養(yǎng)基誘導(dǎo)

根據(jù)史港影等[9]的試驗(yàn)結(jié)果，選擇MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以6-BA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、IBA(0.01、0.02、0.03 mg·L-1)激素組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用全組合試驗(yàn)方法(見表3)，通過觀察叢生芽生長情況，綜合分析激素濃度和激素組合對(duì)叢生芽生長的影響，篩選出叢生芽分化最佳的培養(yǎng)基。

1.2.4芽苗增殖培養(yǎng)

參照史港影等[9]的方法，對(duì)長勢(shì)優(yōu)良的芽苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)。以MS為基本培養(yǎng)基，以6-BA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、NAA(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)、TDZ(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)激素組合，采用正交設(shè)計(jì)表L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)(見表4、表5)，每個(gè)處理接種50瓶，每瓶接種3～4塊叢生芽團(tuán)，置于培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔7 d觀察1次生長情況并做好記錄，40 d為1個(gè)周期，統(tǒng)計(jì)各組合芽苗生長狀況。

表5 6-BA、NAA、TDZ組合對(duì)芽苗增殖的影響

增殖系數(shù)=(一個(gè)周期內(nèi)形成的有效苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%。

1.2.5生根和移栽

培養(yǎng)基MS、1/2 MS和3/4 MS為基本培養(yǎng)基，激素組合參照福建山櫻花的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基IBA 0.5mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1[10,11]。通過觀察芽苗生根狀況，篩選獲得最佳激素組合。

將生長健壯，根系良好的組培苗進(jìn)行移栽。移栽前煉苗，揭蓋，注入稍高于培養(yǎng)基0.3 cm的無菌水，在培養(yǎng)室煉苗2～3 d后進(jìn)行移栽，移栽基質(zhì)第1種配方參考南程慧等[12]的培養(yǎng)基質(zhì)，珍珠巖∶河沙∶蛭石=1∶1∶1；第2種配方參考呂月良等[13]，珍珠巖∶泥炭土=1∶2，第3種配方為珍珠巖∶泥炭土∶蛭石=1∶2∶1。

1.2.6培養(yǎng)條件與統(tǒng)計(jì)方法

培養(yǎng)室溫度26 ℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光/暗(12 h/12 h)培養(yǎng)。

采用SPSS 23軟件和Excel 2016軟件共同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒條件對(duì)莖段污染及愈傷形成的影響

由表1可見，莖段經(jīng)流水沖洗30 min，以0.1%的HgCl2處理5 min時(shí)效果最佳。

表1 莖段滅菌情況

以流水沖洗時(shí)間為例，污染率隨流水沖洗時(shí)間的增加而逐漸減少，但褐化率則隨流水沖洗時(shí)間的增加而逐漸增加，當(dāng)流水沖洗時(shí)間超過30 min時(shí)，污染率逐漸減少，最大僅為3%，當(dāng)流水沖洗時(shí)間為90 min時(shí)，褐化率高達(dá)39%；HgCl2處理與流水沖洗處理情況相同，流水沖洗超過30 min和HgCl2處理超過5 min時(shí)，污染率均為0，而褐化率則逐漸上升，最高達(dá)39%，嚴(yán)重影響了莖段出愈率，此時(shí)出愈率僅為66%，部分發(fā)生褐化的莖段死亡，無法繼續(xù)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。處理6中，流水沖洗30 min，HgCl2處理5 min時(shí)，污染率、褐化率均為0，出愈率97%，效果最佳。

綜上所述，沖洗時(shí)間和HgCl2處理時(shí)間的增加，會(huì)導(dǎo)致莖段污染率降低，褐化率升高，且褐化率對(duì)出愈率影響較大，呈負(fù)相關(guān)性。

圖1 愈傷組織誘導(dǎo)

2.2 不同激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

本研究表明激素組合6-BA 1.0 mg·L-1+IBA0.02 mg·L-1對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，該組合下愈傷組織誘導(dǎo)快，健壯愈傷組織多，顏色黃白色，結(jié)構(gòu)緊密顆粒狀。

由表2可知，高濃度的6-BA誘導(dǎo)愈傷組織速度快，產(chǎn)生愈傷組織量多，但同時(shí)有水漬化現(xiàn)象產(chǎn)生，尤其在6-BA的濃度升高至1.5 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)速度快，量大，結(jié)構(gòu)疏松，質(zhì)地晶瑩剔透，引起玻璃化，后期有根出現(xiàn)，繼代一次后表現(xiàn)為自身生長，不利于分化培養(yǎng)。激素IBA的濃度影響愈傷組織結(jié)構(gòu)的疏密程度，從2、5、8號(hào)處理發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IBA濃度為0.02 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)量少，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密成塊狀，生長速度一般，選擇激素6-BA 1.0 mg·L-1，與激素IBA 0.02 mg·L配合使用時(shí)，愈傷組織呈現(xiàn)黃白色，質(zhì)地緊密，后期逐漸變綠，有利于后期分化叢生芽。

表2 6-BA、IBA激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖2 愈傷組織分化叢生芽

2.3 不同激素組合對(duì)分化叢生芽的影響

由表3可知，激素組合6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1對(duì)分化叢生芽效果最佳。

表3 6-BA、IBA激素組合對(duì)分化叢生芽的影響

激素6-BA濃度會(huì)影響愈傷組織分化叢生芽。在1～6號(hào)處理中，激素6-BA的濃度為0.5～1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)增殖少，有綠色顆粒狀物出現(xiàn)，部分有芽眼出現(xiàn)；在7～9號(hào)處理中，激素6-BA的濃度為1.5 mg·L-1時(shí)，愈傷組織增殖快，偶有綠色團(tuán)塊出現(xiàn)，無芽眼分化，有水漬化出現(xiàn)，且繼代一次后，綠色團(tuán)塊組織生長加快，有明顯膨大現(xiàn)象，伴隨水漬化出現(xiàn)，喪失分化的能力。結(jié)合以上現(xiàn)象得出，高濃度的6-BA不利于愈傷組織分化叢生芽。

當(dāng)激素IBA濃度為0.03 mg·L-1時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)為膨大生長，無芽體分化，而當(dāng)激素IBA濃度為0.01 mg·L-1時(shí)，分化最多，分化率為43.33%。說明高濃度的IBA不利于分化叢生芽。

IBA與6-BA配合使用時(shí)，當(dāng)6-BA濃度在(0.5、1.0 mg·L)和IBA濃度在(0.01、0.02 mg·L-1)之間，愈傷組織均有綠色顆粒出現(xiàn)，繼代一次后，愈傷組織塊變緊實(shí)，芽眼出現(xiàn)，4號(hào)、5號(hào)均有芽體分化。

2.4 不同激素組合對(duì)芽苗增殖的影響

由表4可知，6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+TDZ 0.1～0.2 mg·L-1為芽苗增殖激素組合，最高增殖系數(shù)為503.33%。

由表3可知，激素6-BA和NAA各水平間差異不大，TDZ各水平間差異明顯，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，以1.0～1.2 mg·L-1時(shí)增殖效果較好，綜合增殖系數(shù)與芽苗生長狀況(表4)來看，激素6-BA濃度和激素NAA濃度對(duì)芽苗增殖的質(zhì)量影響較大，在7、8、9號(hào)處理中，當(dāng)激素6-BA濃度為1.5 mg·L-1時(shí)，芽苗增殖快，節(jié)間明顯增長，新生叢生芽多，但小葉葉型狹小細(xì)長，后期生長慢，仍有彎曲皺縮現(xiàn)象，長勢(shì)弱，有玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)，因此，高濃度的6-BA不利于芽苗的健壯。在1、4號(hào)處理中，當(dāng)激素NAA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，芽苗表現(xiàn)出葉小，節(jié)間變化不明顯，新生叢生芽少的現(xiàn)象，但芽苗生長健壯，活力強(qiáng)，因此，低濃度的NAA有利于芽苗增殖生長。添加激素TDZ后，新生叢生芽生長明顯增多，生長速度加快，新葉顏色淺綠。

注：A為健壯增殖芽苗；B、C為細(xì)弱增殖芽苗。圖3 芽苗增殖

表4 6-BA、NAA、TDZ水平間增殖系數(shù)多重比較

通過正交試驗(yàn)的方法，繼代一次后，芽苗長勢(shì)良好，節(jié)間伸長明顯，新生叢生芽逐漸生長，顏色淺綠，葉變大，葉片出現(xiàn)卷縮成柱狀的現(xiàn)象有所改善；繼代二次后，叢生芽生長健壯，葉色綠色，葉片開展正常，可直接切分進(jìn)行壯苗生根，部分叢生芽出現(xiàn)徒長現(xiàn)象，后期經(jīng)過復(fù)壯處理，使其可進(jìn)行生根培養(yǎng)，而部分細(xì)弱芽苗為提高成活率，需繼代復(fù)壯多次后方可進(jìn)行生根培養(yǎng)。

2.5 基本培養(yǎng)基及激素對(duì)芽苗生根的影響

由表6可知，生根培養(yǎng)基選擇3/4 MS基本培養(yǎng)基效果最好。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基和1/2 MS培養(yǎng)基生根時(shí)間久，3/4 MS培養(yǎng)基用時(shí)最短。從長勢(shì)看，MS培養(yǎng)基中同時(shí)長出4～5條主根，無須根，長度大致相同，顏色白色，生長速度一般，10 d后，由白色漸轉(zhuǎn)變成米黃色，主根停止生根，1/2 MS培養(yǎng)基中主根短小膨脹成紡錘狀，15 d后，尖端生出細(xì)弱的根，后期主根停止生長，變褐死亡。3/4 MS培養(yǎng)基中生根快，最早記錄在3 d后就有一個(gè)白色根尖冒出，后持續(xù)生根，主根健壯，白色，在生長主根處或主根上產(chǎn)生須根，須根生根較主根生長晚3～5 d，后期主根漸變成黃白色，須根仍呈現(xiàn)白色。

表6 基本培養(yǎng)基對(duì)芽苗生根的影響

由表6可見，激素組合NAA 0.5 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1對(duì)生根誘導(dǎo)效果最佳，具體表現(xiàn)為生根速度快，主須根適宜，且生長健壯。

表7 NAA和IBA組合對(duì)生根的影響

注：A為正常生根；B為無須根生根；C為根系膨大生根。圖4 生根情況

注：A為培養(yǎng)室煉苗；B為覆膜移栽；C為移栽成苗。圖5 煉苗移栽

1、5、9號(hào)處理，當(dāng)NAA的濃度與IBA濃度比值為1時(shí)，根系生長狀況較好，主根生根快，根系白色健壯，須根量多，幼苗上部分生長良好，葉片開展良好，節(jié)間增長，上部與下部協(xié)調(diào)生長，后期須根在主根生出處或主根上長出，顏色白色，量多。

2.6 不同基質(zhì)組合對(duì)成活率的影響

由表8可知，基質(zhì)組合珍珠巖∶泥炭土∶蛭石=1∶2∶1移栽成活效果最佳，成活率最高達(dá)53.34%。由于幼苗在培養(yǎng)室微環(huán)境與室外環(huán)境差距很大，對(duì)移栽成活率影響較大。當(dāng)珍珠巖、河沙和蛭石組合時(shí)，由于珍珠巖和河沙持水量弱，因此其組合移栽成活率最低，僅有20%，珍珠巖和泥炭土組合時(shí)，大比重的泥炭土?xí)斐煞e水，不利于根系生長，因此其組合移栽成活率為40%，移栽基質(zhì)的要求是既要保水保營養(yǎng)，又要透氣促進(jìn)根呼吸，因此基質(zhì)組合珍珠巖∶泥炭土∶蛭石=1∶2∶1時(shí)成活率最高，為53.33%。

表8 成活率情況

3 討論與結(jié)論

木本植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)是建立無菌體系，外植體的選擇和消毒方法至關(guān)重要[14]，對(duì)不同取材部位進(jìn)行滅菌時(shí)間也不同，已建立的櫻屬植物組培快繁體系多以幼嫩莖段為外植體[4、15-18]，推測原因是幼嫩莖段中所含的植物內(nèi)源激素較多，細(xì)胞活力強(qiáng)，有利于脫分化與再分化。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素(BA或KT)與生長素(IBA或NAA)的激素濃度配比對(duì)櫻花的啟動(dòng)培養(yǎng)影響效果較顯著，且低濃度的IBA和低濃度的6-BA有利于愈傷組織誘導(dǎo)和分化[2,19]，本試驗(yàn)采用不同濃度6-BA和IBA組合進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)良好。培養(yǎng)基中添加Vc，有效降低分化過程中的愈傷組織褐化率[20-22]，本試驗(yàn)在愈傷組織分化叢生芽時(shí)添加Vc 30 mL·L-1。陳志偉等發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加0.5 mg·L-1的IBA可有效誘導(dǎo)生根，生根率達(dá)100%[23]；Sarropoulou[24]在2種櫻桃枕木生根培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，IBA和L-精氨酸濃度的組合中，根長度最長38 mm；藤原直哉[25]在四季櫻組培中發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中添加NAA有利于不定根的產(chǎn)生。本試驗(yàn)采用不同濃度NAA和IBA組合進(jìn)行生根誘導(dǎo)，生根快，主須根發(fā)達(dá)。

本研究采用間接誘導(dǎo)叢生芽的方式，提高增殖率，短時(shí)間內(nèi)獲得大量芽苗，亦可保留植株的優(yōu)良性狀，減少菌體污染。結(jié)果表明，以幼嫩莖段為外植體，采用75%乙醇消毒30 s，0.1%的HgCl2處理5 min，無污染出現(xiàn)，外植體在1/4 MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.02 mg·L-1培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織速度快，用于分化叢生芽的有效愈傷組織團(tuán)量大，后轉(zhuǎn)接分化叢生芽培養(yǎng)基1/4 MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1+Vc 30 mL·L-1中，芽眼生長快，叢生芽分化率高，叢生芽增殖的培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+TDZ 0.1～0.2 mg·L-1+CH 500 mg·L-1，最高增殖系數(shù)為503.33%。生根的最佳培養(yǎng)基配方為3/4 MS+NAA0.5 mg·L+IBA 0.5 mg·L-1，平均生根時(shí)間為5 d。移栽前，盡量沖洗干凈根系培養(yǎng)基，注意動(dòng)作輕柔，避免損傷根系，移栽的最佳基質(zhì)配方是珍珠巖∶泥炭土∶蛭石=1∶2∶1，移栽成活率達(dá)53.33%。由于幼苗在培養(yǎng)室微環(huán)境與室外環(huán)境差距很大，對(duì)移栽成活率影響較大，為盡快度過培養(yǎng)基與基質(zhì)之間提供營養(yǎng)的環(huán)境，在室外進(jìn)行覆膜遮蓋，控溫保濕，提高幼苗的成活率。