貯藏溫度和含水量對黨參種子活力的影響

晉凡生，張彥琴，梁改梅，王君杰，喬 月，牛鐵泉，常建忠，高秀萍,

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，有機(jī)旱作山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，太原 030006；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

黨參(Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.)為桔?？贫嗄晟荼局参颷1]，有抗缺氧、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血糖等多種作用[2]，在醫(yī)藥衛(wèi)生、保健、藥膳等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，需求量逐年增加[3]。黨參適宜多樣的生態(tài)環(huán)境，在我國山西、甘肅等主產(chǎn)區(qū)，大多種植于干旱半干旱的丘陵、山區(qū)[4,5]。黨參以種子繁殖，但其種子貯藏性差，在室溫下貯藏1年后，發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別降到50%以下和30%以下[2,6]，貯藏2年后，發(fā)芽率不足10%[6]，致使實(shí)際生產(chǎn)用種質(zhì)量良莠不齊。優(yōu)質(zhì)種子是作物高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的重要前提與基礎(chǔ)。如何提高種子耐藏性是黨參標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)中不可忽視的重大問題。

貯藏溫度和含水量是影響種子貯藏期間保持活力的關(guān)鍵因素[7]。種子超干貯藏，即將種子含水量降至5%以下，密封后在室溫條件下或稍微降溫的條件下貯藏，作為一項(xiàng)新技術(shù)已普遍為人們所關(guān)注[8]。Ellis等[9]早期研究表明，芝麻種子含水量從5%降低至2%，其貯藏壽命延長40倍，并證明2%含水量的芝麻種子貯藏在20 ℃條件下與5%含水量種子貯藏在-20 ℃條件下效果相同。目前超干處理提高種子耐藏性的效果已在多種作物上得到證明，并已被世界各國科學(xué)家認(rèn)可[8-12]。但不同的植物種子最佳貯藏溫度和含水量存在差異，而且種子超干貯藏的最佳含水量范圍在不同溫度下并不相同[11,13]。對黨參種子適宜貯藏溫度和最佳含水量的研究目前少見報(bào)道。本試驗(yàn)研究了不同含水量黨參種子在不同溫度下貯藏24個(gè)月期間活力的變化，以期探索黨參種子適宜的貯藏條件，為黨參種子保存和生產(chǎn)用種提供科學(xué)依據(jù)與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

黨參種子于2014年9月采自山西省陵川縣六泉鄉(xiāng)黃松背村栽培的二年生黨參種株，經(jīng)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)王玉慶教授鑒定為桔?？浦参稂h參(C.pilosula)的種子。采后陰干保存于4 ℃冰箱。貯藏試驗(yàn)于2015年2月開始。

1.2 方 法

1.2.1種子含水量測定

采用國際種子檢驗(yàn)協(xié)會(1985)的低恒溫烘干法，(103±2)℃恒溫烘干15 h。種子含水量(%)=[(樣品烘前質(zhì)量-樣品烘后質(zhì)量)/樣品烘前質(zhì)量]×100%。2次重復(fù)。

1.2.2種子干燥處理與貯藏

采用室溫硅膠干燥法[13]。將種子裝入尼龍網(wǎng)袋，埋于干燥器內(nèi)硅膠中，硅膠與種子質(zhì)量比為5∶1，室溫下脫水干燥，每天更換經(jīng)120 ℃充分干燥后冷卻的硅膠。每隔一定時(shí)間稱重，制備不同含水量的種子。種子含水量分別為6.17%(自然含水量)、5.80%、5.13%、4.55%、3.82%、3.36%、2.38%和1.52%。將不同含水量的種子用鋁箔袋密封，分別貯藏于-4 ℃、0 ℃、4 ℃和常溫條件下。于貯藏前和貯藏9個(gè)月、15個(gè)月、24個(gè)月測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3種子發(fā)芽試驗(yàn)

各處理種子取出后，先置于室內(nèi)開放條件下平衡含水量7 d后，再參照蘇寧寧等[2]的方法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每個(gè)培養(yǎng)皿擺放飽滿一致的種子50粒，3次重復(fù)。于20 ℃、光照14 h黑暗10 h條件下培養(yǎng)。每天定時(shí)觀察記錄發(fā)芽種子數(shù)(以胚根突破種皮1 mm視為發(fā)芽)，5 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢，10 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)。

GP(%)=(10 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

GR(%)=(5 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

GI=∑(Gt/Dt)，Gt為t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.2.4酸性磷酸脂酶(ACP)活性測定

取0.1 g種子，參照李玉榮等[14]的方法測定。在0.2 mL反應(yīng)體系中加入酶液0.1 mL，30 ℃水浴10 min，再加入氫氧化鈉溶液，待生成的對硝基苯酚呈黃色，終止反應(yīng)，在400 nm處測定光密度，計(jì)算酶活性。重復(fù)3次。

1.2.5抗氧化酶活性測定

取0.3 g種子，用50 mmol·L-1pH值7.0的磷酸緩沖液冰浴研成勻漿，4 ℃下12 000 r·min-1離心20 min，制備酶提取液。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法[1,5]、過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度計(jì)法[16]測定。重復(fù)3次。

1.2.6相對電導(dǎo)率測定

取種子0.2 g，清水洗凈后，用去離子水漂洗3次，置具塞刻度試管中，加去離子水20 mL，24 ℃下浸泡12 h，用DDS-11 A型電導(dǎo)儀測定浸出液的電導(dǎo)率，然后于沸水浴中煮沸20 min，冷卻后再次測定浸出液的電導(dǎo)率，計(jì)算相對電導(dǎo)率[13]。重復(fù)3次。

相對電導(dǎo)率(%)=(煮沸前電導(dǎo)率值/煮沸后電導(dǎo)率值)×100%。

1.2.7數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003軟件和SAS 8.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度和含水量對黨參種子萌發(fā)及活力的影響

2.1.1貯藏溫度和含水量對黨參種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)的影響

從表1～表3可見，在不同溫度下貯藏24個(gè)月，各含水量黨參種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)總體低于貯藏前。在4～-4 ℃低溫下貯藏24個(gè)月，含水量在5.13%～1.52% 區(qū)間的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)僅比貯藏前略有下降；含水量6.17%和5.80%的種子發(fā)芽率與其它含水量的種子基本相同，但發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)明顯下降；在此溫度范圍內(nèi)各貯藏階段，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)在不同含水量間、不同溫度間均無顯著差異。

表1 貯藏溫度和含水量對黨參種子GP的影響

表2 貯藏溫度和含水量對黨參種子GR的影響

表3 貯藏溫度和含水量對黨參種子GI的影響

在常溫下貯藏，不同含水量的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長呈現(xiàn)出顯著差異，貯藏時(shí)間愈長，差異愈大。在常溫下貯藏9個(gè)月，含水量6.17%(自然含水量)的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)較貯藏前分別下降了47.7%、60.8%和48.8%，而含水量在5.80%～1.52%區(qū)間的種子變化較小，此區(qū)間內(nèi)各含水量的種子無顯著差異。常溫下貯藏15個(gè)月后，不同含水量種子間的活力差異增大。到常溫貯藏24個(gè)月時(shí)，含水量6.17%的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢分別僅為32.6%和10.6%；含水量在5.80%～3.82%區(qū)間的種子仍有較高的發(fā)芽率(69.3%～83.4%)，但其發(fā)芽勢已下降到31.3%～36.0%，較貯藏前下降了56.5%～61.8%，發(fā)芽指數(shù)下降了36.1%～46.4%；而含水量在3.36%～1.52%區(qū)間的種子發(fā)芽率仍維持在90%以上，與4～-4 ℃低溫貯藏同期的基本一致，僅較貯藏前略有下降，其發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)比含水量≥3.82%的種子下降的幅度較小，僅分別比貯藏前下降了16.8%～30.0%和13.5%～25.6%，但均低于4～-4 ℃低溫貯藏同期的種子。

2.1.2貯藏溫度和含水量對黨參種子酸性磷酸酯酶活性的影響

表4結(jié)果顯示，黨參種子酸性磷酸酯酶(ACP)活性的測定結(jié)果呈現(xiàn)出與發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)基本相同的趨勢。在4 ℃低溫下貯藏24個(gè)月，不同含水量的種子酸性磷酸酯酶活性無顯著差異，除含水量6.17%和5.80%的種子較貯藏前降低略多外，其它種子僅稍有下降。在常溫下貯藏24個(gè)月，不同含水量的種子酸性磷酸酯酶活性出現(xiàn)了不同程度的降低，含水量間差異顯著。含水量6.17%的種子酸性磷酸酯酶活性降幅最大，較貯藏前下降了53.2%；含水量在5.80%～3.82%區(qū)間的種子下降了25.9%～37.2%；而含水量在3.36%～1.52%區(qū)間的種子僅下降了12.2%～16.2%，此區(qū)間內(nèi)不同含水量間無顯著差異，但均顯著高于含水量≥3.82%的種子。從表4也可看出，含水量在3.36%～1.52%區(qū)間的種子酸性磷酸酯酶活性低于4 ℃低溫貯藏同期的種子。由此可見,酸性磷酸酯酶活性可作為評價(jià)黨參種子質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

表4 貯藏溫度和含水量對黨參種子ACP活性的影響

2.2 貯藏溫度和含水量對黨參種子抗氧化酶活性的影響

表5結(jié)果表明，各含水量的黨參種子在4 ℃低溫和常溫條件下貯藏24個(gè)月，SOD、CAT活性均有下降。在4 ℃低溫下貯藏，不同含水量的種子SOD、CAT活性均無顯著差異，但仍表現(xiàn)為含水量6.17%和5.80%的種子酶活性下降較多。在常溫下貯藏，含水量在3.36%～1.52%區(qū)間的種子SOD、CAT活性顯著地高于含水量≥3.82%的種子，并維持在較高水平，僅略低于4 ℃低溫貯藏同期的種子，分別較后者低8.2%～9.8%和3.7%～9.8%。SOD、CAT活性的變化與種子活力變化的趨勢基本一致。

表5 貯藏溫度和含水量對黨參種子SOD、CAT活性與相對電導(dǎo)率的影響

2.3 貯藏溫度和含水量對黨參種子相對電導(dǎo)率的影響

由表5可見，含水量6.17%～1.52%的黨參種子在4 ℃低溫和常溫條件下貯藏24個(gè)月的過程中，相對電導(dǎo)率均未發(fā)生明顯變化。

3 討論與結(jié)論

眾多研究表明，大部分植物種子在常溫下超干貯藏效果良好[8,17]，但超干保存種子的最適含水量因植物種類和貯藏溫度而異[11,13,17]。Ellis等的研究表明，許多作物種子超干貯藏的最適含水量為2%～6%，隨著種子含水量的進(jìn)一步降低，生活力反而下降[9,18,19]；其原因可能與干燥損傷、生物膜系統(tǒng)的破壞以及脂質(zhì)過氧化加劇等密切相關(guān)[8]。何序晨等研究發(fā)現(xiàn)，皖雜一號西瓜種子超干貯藏的最適含水量為1.60%～4.17%[8]。也有研究指出，油料種子當(dāng)含水量下降至1%以下時(shí)仍能保持活力[11]。李先恩[12]早期的研究表明，黨參超干處理的種子(含水量3.43%)室溫貯存1年后仍保持較高的發(fā)芽率，說明超干貯藏可提高黨參種子的耐藏性。本研究得到了與李先恩相一致的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)黨參種子含水量降低到3.36%～1.52%時(shí)，常溫貯藏24個(gè)月后仍保持較高的活力，由此還可看出，當(dāng)含水量降低到2%以下時(shí)，黨參種子活力并未受影響。根據(jù)熱力學(xué)D’Acry/Watt分析，種子中水分由3部分組成，其中一部分稱為結(jié)構(gòu)水(系以單個(gè)水分子為結(jié)合對象的強(qiáng)吸附位點(diǎn)上所結(jié)合的水)，這部分水一般與離子基團(tuán)(如蛋白質(zhì)中電離的羧基和氨基)結(jié)合，屬于真正的生命水，對維持生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的完整性是必不可少的，若丟失結(jié)構(gòu)水，將導(dǎo)致種子活力降低，干燥處理后能否存活也取決于細(xì)胞對結(jié)構(gòu)水的保持能力[11]。程紅焱等研究指出，油菜、花生和芝麻種子在極度干燥下，種子內(nèi)結(jié)構(gòu)水不易丟失，對種子活力無影響，并有很好的耐藏性[20]。黨參種子含水量降到2%以下仍能保持較高活力，和其結(jié)構(gòu)水可能沒有丟失有關(guān)。

種子貯藏的最適含水量也受溫度的影響，溫度越高，貯藏的最適含水量越低[11]，并且，隨著貯藏溫度的下降，最適含水量范圍變寬[13]。本研究表明，黨參種子在24個(gè)月的貯藏期內(nèi)，當(dāng)溫度由常溫降低到4 ℃時(shí)，最適含水量范圍由3.36%～1.52%變寬至5.13%～1.52%，但當(dāng)溫度繼續(xù)下降到-4 ℃時(shí)，最適含水量范圍保持不變。

本研究也顯示，黨參種子在貯藏過程中，抗氧化酶SOD、CAT活性基本呈現(xiàn)出隨含水量或溫度降低而下降變緩的趨勢，并與種子活力的變化相一致，說明黨參種子在低溫低水下能保持較高的活力是與其相對較高活性的抗氧化酶系統(tǒng)密切相關(guān)的。但黨參種子的相對電導(dǎo)率與其活力并不相關(guān)。以往對新麥草[14]、黑麥草、雀麥、蘇丹草[21]等的研究也發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率與種子生活力不相關(guān)的結(jié)果。

綜合分析結(jié)果表明，降低溫度和超干處理可提高黨參種子的耐藏性。在常溫下貯藏24個(gè)月，黨參種子的最適含水量范圍為3.36%～1.52%；在4～-4 ℃低溫下貯藏24個(gè)月，黨參種子的最適含水量范圍為5.13%～1.52%。低溫低水可提高黨參種子耐藏性與其保持了相對較高的抗氧化酶活性密切相關(guān)，但其機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。