扶正固本法抑制乳腺癌骨破壞的作用及機(jī)制研究※

●周瑞娟 張秋萍 盧曉惠 文 娛 陳雪梅 陳雋鵬 徐樂勤

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占所有腫瘤的10.4%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。在我國，每年新發(fā)乳腺癌病例約26.9 萬，已躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位[2]。尤其是近年來我國乳腺癌發(fā)病率快速上升，它已成為我國女性六大癌癥死亡原因之一[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，近50%的晚期乳腺癌患者有骨轉(zhuǎn)移，約70%乳腺癌死于骨轉(zhuǎn)移[4]。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致患者遭受骨痛、高血鈣、骨折、截癱以及惡病質(zhì)等痛苦，嚴(yán)重影響其生存期及生活質(zhì)量[5]。因此，探索具有防治或延緩乳腺癌骨轉(zhuǎn)移、骨破壞的藥物具有極為重要的臨床意義。

在乳腺癌患者長期的綜合治療中，中醫(yī)藥的作用已經(jīng)得到廣泛肯定[6]。陸德銘教授[7]認(rèn)為，乳腺癌病性本虛而標(biāo)實(shí)，治療強(qiáng)調(diào)“養(yǎng)正積自除”，主張“扶正為主，祛邪為輔”，扶正固本為防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要方法。扶正時(shí)尤重脾腎，若脾腎不足，則先后天平衡失調(diào)，致使正氣內(nèi)虛。臨床常選用黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、陳皮等益氣養(yǎng)血健脾和胃，扶助氣血、顧護(hù)后天，使氣血生化有源；選用淫羊藿、補(bǔ)骨脂、巴戟天、鹿角片等補(bǔ)益腎氣，調(diào)攝沖任，固攝先天，使先后天平衡，正氣得固，則邪氣易被殺滅或祛除，防止或延緩了骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[8，9]。唐漢鈞[10]認(rèn)為，本病系毒邪內(nèi)攻入骨，肝腎虧損所致。也有學(xué)者[11]分析了近幾年中國學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)中治療骨轉(zhuǎn)移癌的內(nèi)服方劑，發(fā)現(xiàn)組方規(guī)律是以扶正補(bǔ)虛為基本治則，補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、淫羊藿3味藥出現(xiàn)頻次最高。

因此，依據(jù)扶正固本的根本治則，本實(shí)驗(yàn)選取具健脾補(bǔ)腎功效的中藥，擬定基本方（由黃芪、黨參、茯苓、淫羊藿、補(bǔ)骨脂等藥物組成），通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討扶正固本方藥減輕骨破壞的作用及其可能的分子機(jī)制，為中醫(yī)藥防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移、骨破壞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑與藥品TRAP 染色試劑盒（購自Sigma 公司），細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胰酶、胎牛血清、雙抗（購自Gibco 公司），TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、RANKL、OPG、TGF-β、IGF ELISA試劑盒（購自ThermoFisher公司），PTHrP ELISA 試劑盒（購自默沙克公司），PDGF ELISA 試劑盒（購自R&D SYSTEMS 公司），唑來膦酸注射液（購自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司）。扶正固本方（黃芪30g、黨參15g、茯苓9g、淫羊藿30g、補(bǔ)骨脂30g）由廈門市中醫(yī)院中藥房提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸鼠（6～8周齡）購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于廈門大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物中心。

1.3 細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-luc 購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-luc以10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 天換液一次，待細(xì)胞生長至80%～90%，采用0.25%胰酶消化，傳代培養(yǎng)。造模當(dāng)天，采用0.25%胰酶消化培養(yǎng)皿中的MDA-MB-231-luc 細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，經(jīng)800 rpm 離心5 min 后，將沉淀細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2遍，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，采用PBS重懸，使細(xì)胞終濃度為5×104個(gè)/μl細(xì)胞懸液，置于冰上備用。

2.2 動(dòng)物分組選取6～8周齡雌性裸鼠40只，每籠5 只，飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物中心，每三天清理鼠籠一次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。購買到的裸鼠在動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天，確認(rèn)其無烈性傳染病，并基本適應(yīng)新的飼養(yǎng)環(huán)境后，開始下一步實(shí)驗(yàn)。根據(jù)體重排序，采用隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為4 組，分別為空白對(duì)照組、模型組、唑來膦酸組和扶正固本組，每組10只。

2.3 脛骨內(nèi)注射乳腺癌細(xì)胞建立乳腺癌骨破壞動(dòng)物模型所有裸鼠均被置于超凈工作臺(tái)中，采用2.5%的阿弗?。?.3～0.4）ml/20g 麻醉。待裸鼠麻醉后，沿髕骨前方作約1cm～2cm 縱形皮膚切口，沿髕韌帶邊緣作1cm 切口，暴露脛骨上緣。模型組、唑來膦酸組和扶正固本組這三組裸鼠均采用顯微注射器（規(guī)格：26G）向脛骨內(nèi)注射4×104個(gè)螢光素酶標(biāo)記的MDAMB-231-luc 人乳腺癌細(xì)胞（總體積20μl）；空白對(duì)照組則采用顯微注射器向脛骨內(nèi)注射20μl PBS。縫合切口，將裸鼠置于37℃恒溫板上，待裸鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中。

2.4 給藥方法扶正固本組每天灌胃以體表面積換算所得劑量組藥湯劑，為14.82g/kg體重[計(jì)算方法：小鼠的給藥量（g/kg）=成人劑量（g/kg）×（人的轉(zhuǎn)換因子/小鼠的轉(zhuǎn)換因子）]；唑來膦酸組皮下注射唑來膦酸，0.2mg/kg 體重；空白對(duì)照組和模型組每天只灌胃相應(yīng)劑量的生理鹽水。各組均每周給藥3次，連續(xù)給藥28天。觀察裸鼠外觀及行為，拍照并記錄其體重變化。

2.5 小鼠活體成像根據(jù)裸鼠的體重，側(cè)腹腔注射相應(yīng)劑量的Luciferase-D 熒光底物，5min 后將裸鼠置于麻醉箱氣體麻醉。將麻醉好的裸鼠置于IVIS?-200 動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)中熒光成像，觀察腫瘤的大小。

2.6 小鼠X線檢查為觀察乳腺癌引起的骨質(zhì)破壞程度，采用阿弗丁麻醉裸鼠后，將裸鼠置于柯達(dá)X 線成像系統(tǒng)中，拍照觀察乳腺癌骨轉(zhuǎn)移或骨內(nèi)注射后引起的骨質(zhì)破壞面積百分比（骨質(zhì)破壞面積百分比=骨破壞面積÷脛骨骨質(zhì)總面積×100%）。

2.7 血清ELISA檢測(cè)于末次給藥后2 h，用剪鑷快速摘除眼球取血，收集各組裸鼠的血液放入促凝管中，4℃下靜置1 h，室溫3000 rpm 離心5 min，分離血清，采用ELISA 陣列試劑盒檢測(cè)裸鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、PTHrP、RANKL、OPG、TGF-β、IGF、PDGF 細(xì)胞因子的表達(dá)水平，以空白對(duì)照組為基礎(chǔ)值計(jì)算給藥后裸鼠血液中以上細(xì)胞因子的表達(dá)改變。具體操作根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

2.8 脛骨TRAP 染色麻醉處死裸鼠，取出脛骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24h后，經(jīng)0.5M的EDTA脫鈣10天，再經(jīng)梯度乙醇、二甲苯、石蠟浸泡（即脫水至蠟處理），石蠟包埋，切成4μm 厚度切片，挑選包含骨髓腔的脛骨切片，按常規(guī)脫蠟至水后，采用TRAP染色試劑盒進(jìn)行組織染色。

2.9 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0 For Windows 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。先對(duì)各組數(shù)值變量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)；服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步檢驗(yàn)方差齊性。方差齊時(shí)多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析和LSD-t法檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用Welch檢驗(yàn)和Dunnett's T3法檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 扶正固本方對(duì)乳腺癌在骨環(huán)境中生長的影響根據(jù)各組裸鼠脛骨內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的熒光值情況（見圖1A），繪制乳腺癌細(xì)胞的生長柱狀圖（見圖1B）。與模型組比，扶正固本組和唑來磷酸組對(duì)乳腺癌細(xì)胞在骨環(huán)境中的生長均產(chǎn)生不同程度的抑制作用。

3.2 扶正固本方對(duì)乳腺癌誘導(dǎo)骨破壞的影響根據(jù)各組裸鼠脛骨X-ray檢測(cè)結(jié)果（見圖2A），繪制骨破壞程度的柱狀圖（見圖2B）。與模型組比，扶正固本組和唑來磷酸組可減輕乳腺癌細(xì)胞引起的骨破壞。

圖1 各組裸鼠IVIS檢測(cè)結(jié)果

圖2 各組裸鼠脛骨內(nèi)X-ray檢測(cè)及骨破壞面積

3.3 扶正固本方對(duì)脛骨破骨細(xì)胞活性的表達(dá)的影響根據(jù)各組裸鼠脛骨切片的TRAP 染色檢測(cè)結(jié)果（見圖3A），繪制TRAP 陽性細(xì)胞數(shù)目的柱狀圖（見圖3B）。與模型組比，扶正固本組和唑來磷酸組對(duì)乳腺癌細(xì)胞引起的破骨細(xì)胞活化均有不同程度的抑制作用。

圖3 裸鼠脛骨TRAP染色及TRAP（+）細(xì)胞數(shù)目

3.4 扶正固本方對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的表達(dá)的影響表1結(jié)果顯示，扶正固本組和唑來磷酸組炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表達(dá)水平明顯低于模型組，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。表2 結(jié)果顯示，扶正固本組和唑來磷酸組的PTHrP、RANKL（促破骨細(xì)胞形成因子）的表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05）；而OPG（抑制破骨細(xì)胞形成因子）的表達(dá)上升，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.001）。表3結(jié)果顯示扶正固本組和唑來磷酸組血清中細(xì)胞生長因子TGFβ、IGF、PDGF的表達(dá)低于模型組，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。

表1 各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17表達(dá)情況（）

表1 各組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17表達(dá)情況（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

表2 各組小鼠PTHrP、RANKL、OPG表達(dá)情況（）

表2 各組小鼠PTHrP、RANKL、OPG表達(dá)情況（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

表3 各組小鼠TGF-β、IGF、PDGF表達(dá)情況（）

表3 各組小鼠TGF-β、IGF、PDGF表達(dá)情況（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

4 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移屬中醫(yī)學(xué)“骨蝕”“骨瘤”“骨痹”“骨疽”等范疇。骨轉(zhuǎn)移癌可表現(xiàn)出局部腫塊堅(jiān)硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不變、面色晦暗等臨床特征；其發(fā)生、發(fā)展與中醫(yī)的腎和脾關(guān)系密切[12]。《醫(yī)經(jīng)精義》曰：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也?！逼⒛I為互濟(jì)之臟，腎虛久不復(fù)，火不生土，必傷脾陽。《素問·五臟生成》云“腎之合骨也，其榮在發(fā)，其主脾也”，說明脾腎對(duì)骨的充養(yǎng)具有重要作用。扶正固本方由黃芪、黨參、茯苓、淫羊藿、補(bǔ)骨脂組成，具有益氣健脾、補(bǔ)腎壯骨的作用。

正常的骨代謝是通過成骨細(xì)胞的成骨作用與破骨細(xì)胞的骨吸收作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而保持一種動(dòng)態(tài)平衡[13]。當(dāng)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移后，乳腺癌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨基質(zhì)細(xì)胞共同參與骨微環(huán)境的改造。19世紀(jì)英國Paget提出的“土壤和種子”學(xué)說已得到廣泛認(rèn)可，認(rèn)為靶器官內(nèi)適宜血液中播散的腫瘤細(xì)胞生存微環(huán)境是腫瘤發(fā)生的必要條件[14]。目前許多研究證據(jù)表明，腫瘤轉(zhuǎn)移取決于骨微環(huán)境提供的生長支持和癌細(xì)胞對(duì)這一環(huán)境的適應(yīng)能力[15]。骨微環(huán)境包括細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞等，這些細(xì)胞可以產(chǎn)生多種因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程，而乳腺癌細(xì)胞也釋放多種因子并與微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞相互作用，進(jìn)而造成對(duì)骨結(jié)構(gòu)的破壞[16]。

首先，乳腺癌細(xì)胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17 等炎癥因子，一方面刺激成骨細(xì)胞分泌RANKL，另一方面刺激單核細(xì)胞融合成破骨細(xì)胞。其中IL-6 在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡和刺激破骨細(xì)胞生成、抑制成骨細(xì)胞分化中具有重要作用[17]；IL-1β能夠直接刺激破骨細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其活性，促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨質(zhì)吸收[18]。TNF-α 可以刺激IL-1β、IL-6 的產(chǎn)生，從而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡[19]，還可以抑制間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)成熟的成骨細(xì)胞凋亡，加速骨轉(zhuǎn)移灶骨質(zhì)破壞[20]。因此抑制骨轉(zhuǎn)移灶中IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)，可減輕骨損傷、保護(hù)骨組織。本實(shí)驗(yàn)中，扶正固本組骨組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量均明顯低于模型組，提示扶正固本方藥可減少骨轉(zhuǎn)移癌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17 的分泌，從而減輕促炎因子介導(dǎo)的骨損傷以及腫瘤細(xì)胞的增殖。

其次，乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的PTHrP 是主要的破骨細(xì)胞激活因子[21]。在腫瘤骨轉(zhuǎn)移的過程中，起到促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移的作用[22]。PTHrP刺激成骨細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生RANKL，RANKL 通過未成熟破骨細(xì)胞表面的RANK信號(hào)系統(tǒng)，刺激轉(zhuǎn)錄因子起始轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致未成熟的破骨細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞；并且同時(shí)抑制OPG的合成[22，23]。OPG是RANKL的無功能受體，它能與破骨細(xì)胞表面的RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，在體內(nèi)、體外情況下均能抑制破骨細(xì)胞的成熟和活化。目前認(rèn)為RANKL/OPG 的比例是破骨細(xì)胞活性的決定因素之一[24，25]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間失去平衡，促進(jìn)骨吸收作用。在骨轉(zhuǎn)移過程中，OPG 的表達(dá)量會(huì)很低，PTHrP和RANKL 的表達(dá)量增加，這樣就促使骨轉(zhuǎn)移后骨破壞的發(fā)生。而當(dāng)促進(jìn)或抑制相關(guān)調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生時(shí)，就能夠在一定程度上抑制骨的轉(zhuǎn)移。藥理研究顯示，補(bǔ)腎壯骨中藥具有以下的作用：①激活腎臟中1-α 羥化酶，提高骨鈣調(diào)節(jié)激素1，25-(OH)2D3水平；②調(diào)節(jié)垂體-性腺軸或通過植物雌激素成分直接作用于受體而發(fā)揮雌激素樣作用；③減少破骨細(xì)胞的生成，抑制破骨作用；④上調(diào)OPG 的表達(dá)，下調(diào)RANKL的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，起到調(diào)節(jié)骨吸收的作用[26，27]。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)扶正固本方藥對(duì)破骨細(xì)胞形成的相關(guān)調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生了調(diào)控作用，可促進(jìn)OPG的表達(dá)，抑制PTHrP、RANKL 的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的形成。

再者，TGF-β、IGF、PDGF等細(xì)胞生長因子是調(diào)控乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的重要因素[28-30]。TGF-β 是骨代謝中關(guān)鍵的信號(hào)因子，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中能幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控[31]，有利于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并可促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖和分化[32]；骨是TGF-β的主要存儲(chǔ)場(chǎng)所，骨轉(zhuǎn)移溶骨破壞可釋放大量TGFβ，且乳腺癌細(xì)胞直接分泌TGF-β，TGF-β 通過調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路，調(diào)控破骨細(xì)胞活性的主要介導(dǎo)因子PTHrP 等的表達(dá)，加速骨質(zhì)流失[33]；抑制TGFβ及PTHrP的表達(dá)，可截?cái)喙菗p傷惡性循環(huán)，減少骨損傷[34]。在破骨細(xì)胞的骨吸收中，骨中IGF-1 的釋放能刺激乳腺癌細(xì)胞增殖與趨化，并抑制其凋亡。MDAMB-231細(xì)胞中的IGF-1受體的過表達(dá)顯著增加骨轉(zhuǎn)移率，而乳腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞的有絲分裂增加，凋亡減少。低表達(dá)IGF-1 受體則相反。破骨細(xì)胞的骨吸收導(dǎo)致骨中IGF-1的釋放，在刺激細(xì)胞增殖和趨化作用以及抑制轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[35]。ELISA 結(jié)果顯示，扶正固本方藥可減少小鼠血清中細(xì)胞生長因子TGF-β、IGF、PDGF的表達(dá)水平。

綜上所述，扶正固本方藥可通過降低炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17）、細(xì)胞生長因子（TGFβ、IGF、PDGF）以及促破骨細(xì)胞因子（PTHrP、RANKL）的表達(dá)，增加OPG 的表達(dá)，從而減緩乳腺癌骨細(xì)胞在骨環(huán)境中的生長，以及減輕乳腺癌細(xì)胞所引起的骨破壞。