鎘脅迫下能源甜菜BvGST基因在酵母中的功能分析

楊舒涵，王錦霞，郭萌萌，馬龍彪，劉大麗

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱 150080；3.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

重金屬（As、Cr、Pb、Cd等）毒害導(dǎo)致活性氧物質(zhì)（ROS）的形成和積累，并干擾細(xì)胞的氧化還原平衡，進(jìn)而嚴(yán)重地影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1]。作為固生生物的植物在長(zhǎng)期的適應(yīng)過程中，也相應(yīng)地進(jìn)化出了一套調(diào)控防御系統(tǒng)，并激活逆境應(yīng)答機(jī)制來應(yīng)對(duì)有害環(huán)境的毒害[2]。植物體內(nèi)擁有高效的酶促和非酶促抗氧化防御體系，以作用于一系列不可控的氧化反應(yīng)，保護(hù)植物細(xì)胞最大程度地免受毒害。在植物的抗氧化機(jī)制中，用于清除ROS 的酶類[3-4]，如過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等，以及解毒酶（Glu‐tathione S-transferases，GSTs），在直接或間接地保護(hù)細(xì)胞免受逆境傷害中發(fā)揮著重要作用。

Glutathione S-transferases（GSTs，EC 2.5.1.18）作為多功能蛋白之一，由一類高度多樣性的古老的基因家族編碼，并廣泛參與到植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)代謝、逆境耐受、外源毒素和內(nèi)生化合物的解毒過程中。它通過與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）共價(jià)結(jié)合形成多種多樣的三肽疏水親電底物[5]，從而絡(luò)合活性氧物質(zhì)，調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，生物合成、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)次生代謝產(chǎn)物及激素等[6-7]。通過對(duì)包括擬南芥、楊樹和水稻在內(nèi)的植物基因組研究發(fā)現(xiàn)，植物中的GSTs擁有一個(gè)超過55個(gè)成員的龐大的基因家族[8-10]。根據(jù)氨基酸一致性、基因結(jié)構(gòu)和底物特異性，GSTs被分為八大類：Tau、Phi、Lambda、Theta、Zeta、Dehydroascorbate reductase（DHAR）、Elongation factor 1 gamma（EF1Bγ）以及Tetrachlorohydroquinone dehalogenase（TCHQD）[8]。其中，Tau和phi是液泡植物中最豐富的兩種類型的GSTs，并擁有廣泛的底物特異性[11]。由于它們屬于酶活性蛋白，大量的研究集中在結(jié)合基因組學(xué)結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)以及酶促分析等闡述重復(fù)基因的保留和功能分化的功能機(jī)制方面[12]。

除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)，植物GSTs參與眾多細(xì)胞過程，作用于過氧化氫的解毒、花青苷的轉(zhuǎn)運(yùn)、除草劑解毒、生長(zhǎng)素代謝平衡、酪氨酸代謝以及程序性細(xì)胞凋亡的調(diào)控等由于生物及非生物逆境帶來的響應(yīng)[13]，從而保護(hù)植物免遭包括重金屬逆境在內(nèi)的各種非生物逆境的傷害[14-15]。研究表明，擬南芥AtGSTF2 基因與防御相關(guān)化合物的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控有關(guān)[16]，過量表達(dá)AtGSTF2 基因可以提高植物對(duì)苯酚逆境的耐受性[17]。重金屬As 逆境會(huì)導(dǎo)致由于GST 和GPX 基因的誘導(dǎo)表達(dá)而帶來的GSH 含量的增加，從而大量合成植物螯合素以解毒活性氧物質(zhì)[18]。除此之外，研究表明，擬南芥Phi 家族的GSTs 可以被Cu 和Al 誘導(dǎo)表達(dá)[19]；Trichoderma virens GST（TvGST）可以提高真菌對(duì)Cd的耐受性[20]。

雖然GSTs 被證實(shí)與重金屬逆境耐受相關(guān)，然而對(duì)于在重金屬尤其是鎘逆境下GSTs 精確的生理作用和分子機(jī)制還不清楚。甜菜是新興的能源作物，在重金屬污染土壤的生物修復(fù)中表現(xiàn)出了極大的潛力[21]，因此，了解其重金屬耐受作用機(jī)理十分重要。結(jié)合前期的相關(guān)研究[21-23]，我們?cè)趯?duì)能源甜菜重金屬鎘逆境的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的研究中，發(fā)現(xiàn)BvGST基因的差異表達(dá)十分顯著，并通過qRT-PCR 進(jìn)一步確定了該基因與Cd的耐受應(yīng)答相關(guān)。本研究克隆了BvGST 基因，并利用單細(xì)胞酵母重組構(gòu)建及表達(dá)該基因，通過比較分析該基因的表達(dá)真核酵母細(xì)胞中的作用，從而為進(jìn)一步了解BvGST 在能源甜菜體內(nèi)的功能及其在重金屬離子代謝平衡中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 目的基因的克隆

根據(jù)甜菜Beta vulgaris glutathione S-transferase（BvGST，LOC104898671）基因的堿基序列以及酵母表達(dá)載體pYES2 的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物：[Forward primer (5′-3′)：CGGGA TCC(BamHI) ATG GGA ATC AAG ATT CAT GGA AT；Reverse primer(5′-3′)：CCGCTC GAG(XhoI)TTA AGC TTG CTT CAA CAG AGC CAC]。以Trizol法提取的能源甜菜總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA（First strand cDNA synthesis kit，TOYOBO）為模板，利用KOD-Plus-Neo 高保真酶（TOYOBO）擴(kuò)增獲得目的基因全長(zhǎng)。將PCR 產(chǎn)物于25 ℃連接到克隆載體pEASY-T1（Trans‐Gen）上，并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中。提取KanaR陽性克隆質(zhì)粒DNA，并利用BamHI和XhoI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。所獲得的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)一步送往上海生工測(cè)序，確定其堿基序列的正確性和完整性。

1.2 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

利用BamHI 和XhoI分別雙酶切pEASY-T1-BvGST和pYES2質(zhì)粒。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳以及膠回收，利用T4 ligase（NEB）將回收載體和目的片段按照1∶7 的摩爾比于16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，提取AmpR克隆質(zhì)粒DNA，利用BamH I 和Xho I鑒定pYES2-BvGST的正確性。重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到酵母InVSc1中備用。

1.3 酵母RNA的提取

將含有pYES2-BvGST的酵母菌培養(yǎng)于YPGDR 培養(yǎng)基中，從OD600=0.5初始誘導(dǎo)培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h和24 h，收集菌液。加入等體積的Tris 飽和酚以及Lysis buffer（10 mmol/L Tris-HCl pH7.4，10 mmol/L EDTA，0.5%SDS）充分重懸細(xì)胞，65 ℃孵育45 min。經(jīng)過酚、氯仿反復(fù)抽提上層清液，并利用3 mol/L NaAc（pH5.2）以及無水乙醇沉淀獲得酵母RNA。利用紫外分光光度計(jì)NavoVue plus在OD260和OD280下檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.4 半定量RT-PCR

以定量后的酵母RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其中，內(nèi)參Saccharomyces cerevisiae ACT1基因（ACT1，YFL039C）的擴(kuò)增引物為：Forward primer (5′-3′)：TCATGGTCGGTATGGGTCAA；Reverse primer(5′-3′)：TCAGCAGTGGTGGAGAAAGA。Tm=58 ℃；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為487 bp。取20μL PCR 產(chǎn)物，于1.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.5 鎘脅迫下酵母菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將轉(zhuǎn)入pYES2 或pYES2-BvGST 的InVSc1 菌株培養(yǎng)于SC-U（6.7 g/L yeast nitrogen base、200 mg/L-Uracil DO supplement和2%glucose）培養(yǎng)基直到OD600=0.5。收集菌液并培養(yǎng)于含有0.5 mmol/L CdCl2的YPGDR（1%yeast extract、2%peptone、1.94% galactose、0.06%glucose 和1%raffinose）液體培養(yǎng)基中，30 ℃，每隔一定時(shí)間間隔，于OD600測(cè)一次菌液濃度，制作生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 能源甜菜BvGST基因的克隆

根據(jù)能源甜菜Beta vulgaris glutathione S-transferase（BvGST，LOC104898671）基因的堿基序列，在該基因起始密碼子和終止密碼子兩端設(shè)計(jì)分別帶有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的特異引物，以能源甜菜總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板擴(kuò)增該目的基因。如圖1-A 所示，經(jīng)過RT-PCR 及瓊脂糖凝膠檢測(cè)，利用高保真Taq 酶擴(kuò)增BvGST基因，在642 bp 左右的位置獲得了目的條帶。此PCR產(chǎn)物與目的基因在Genbank里的序列大小一致，無雜帶，可以直接用于下一步的載體構(gòu)建。

將BvGST基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到克隆載體pEASY-T1上。如圖1-B所示，經(jīng)過E.coli轉(zhuǎn)化、Kana抗性篩選陽性克隆、質(zhì)粒提取以及BamHI、XhoI 限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，實(shí)驗(yàn)分別在3.928 kb 和642 bp 左右的位置上，獲得了相對(duì)應(yīng)于載體pEASY-T1 和目的基因片段BvGST 的條帶。將陽性重組質(zhì)粒測(cè)序，通過Blast堿基序列比對(duì)，最終確定了pEASY-T1-BvGST克隆的目的基因的正確性。

圖1 能源甜菜BvGST基因的克隆Fig.1 Cloning of energy beet BvGST gene

2.2 酵母pYES2-BvGST表達(dá)載體的構(gòu)建

提取酵母pYES2質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI將pYES2質(zhì)粒和pEASY-T1-BvGST質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到帶有特異性連接的粘性末端的載體和目的片段（圖2-A）。膠回收目的條帶，通過T4 連接酶過夜連接以及大腸桿菌轉(zhuǎn)化，所獲得的的Amp 抗性克隆的質(zhì)粒DNA 經(jīng)過BamHI 以及XhoI 的雙酶切鑒定，分別在5.9 kb和642 bp 左右的位置獲得了相應(yīng)的目的條帶，從而獲得正確的酵母重組質(zhì)粒pYES2-BvGST（圖2-B）。將陽性克隆轉(zhuǎn)入酵母InVSc1中以進(jìn)行下一步的檢測(cè)及功能分析。

圖2 pYES2-BvGST重組質(zhì)粒的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid of pYES2-BvGST

2.3 BvGST基因在酵母體內(nèi)的表達(dá)

為了進(jìn)一步檢測(cè)重組質(zhì)粒pYES2-BvGST在酵母InVSc1中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)將重組菌培養(yǎng)于誘導(dǎo)型培養(yǎng)基YPGDR 中，適量誘導(dǎo)表達(dá)目的基因BvGST，以酵母ACT1 基因作為內(nèi)參基因。Semi-quantitative PCR 研究表明，經(jīng)過半乳糖的誘導(dǎo)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，與酵母ACT1基因的表達(dá)幾乎沒有變化相比，BvGST 基因的表達(dá)量卻在逐漸增加（圖3），從而實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了甜菜BvGST 基因在重組酵母菌體內(nèi)可以被誘導(dǎo)并正確地表達(dá)。

圖3 BvGST基因在酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Induction and expression of BvGST gene in yeast cells

2.4 鎘脅迫下甜菜BvGST基因在酵母體內(nèi)的功能分析

為了分析在重金屬鎘逆境下，BvGST 基因在酵母菌體內(nèi)的功能，實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)化pYES2 空載體的酵母為對(duì)照，通過半乳糖以及葡萄糖的誘導(dǎo)抑制組合，分析目的基因的表達(dá)是否可以提高酵母對(duì)Cd的耐受性。如圖4所示，在正常生長(zhǎng)條件下，即沒有重金屬逆境脅迫的條件下，無論是YPD 抑制表達(dá)培養(yǎng)基還是在YPGDR 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的兩組酵母的生長(zhǎng)速率幾乎持平，說明BvGST 基因的表達(dá)對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)沒有明顯的影響。與之相反的是，在Cd逆境脅迫下，無論是對(duì)照還是含有目的基因的重組菌，在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)均受到了抑制，生長(zhǎng)緩慢并在一定階段伴隨著下降的趨勢(shì)；但在YPGDR 培養(yǎng)基中，適量表達(dá)BvGST基因的酵母的生長(zhǎng)趨勢(shì)要明顯優(yōu)于對(duì)照pYES2酵母菌。這些數(shù)據(jù)表明，能源甜菜BvGST在酵母內(nèi)的表達(dá)在鎘逆境脅迫下的生長(zhǎng)和耐受性的提高中發(fā)揮著重要作用。

圖4 鎘脅迫下重組酵母菌的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of recombinant yeast under cadmium stress

3 討論

在重金屬逆境脅迫以及相關(guān)的生物修復(fù)研究中，鎘被認(rèn)為是一類高毒性的離子，它可以通過植物根部吸收并通過輸導(dǎo)組織被運(yùn)送到其它部位的細(xì)胞、組織及器官中，引發(fā)次級(jí)逆境-氧化逆境的發(fā)生，進(jìn)而直接或間接對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。而在谷胱甘肽作為二硫還原劑，介導(dǎo)調(diào)控由于重金屬逆境所引起的基因表達(dá)中，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Glutathione S-transferases（GSTs）扮演著重要的角色[24]。除此之外，植物GSTs 在對(duì)生長(zhǎng)素的細(xì)胞應(yīng)答以及植物次生產(chǎn)物的代謝過程發(fā)揮著重要作用?？梢?，了解BvGST 基因的作用機(jī)制和分子功能，對(duì)于解讀能源甜菜在Cd逆境下的基因應(yīng)答調(diào)控機(jī)理十分重要。

前期的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬逆境會(huì)對(duì)能源甜菜的生長(zhǎng)造成一定程度的影響[21]。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)，在眾多基因的脅迫應(yīng)答過程中，能源甜菜BvGST基因的差異表達(dá)極其顯著。因此，本研究利用RT-PCR 技術(shù)克隆了該基因，并將其重組表達(dá)于酵母這一真核單細(xì)胞生物體內(nèi)以研究其作用機(jī)制。通過半乳糖以及葡萄糖組合的適量誘導(dǎo)表達(dá)目的基因，發(fā)現(xiàn)該基因在重金屬鎘逆境脅迫下，可以在一定程度上提高酵母菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和對(duì)Cd離子的耐受性。

在以往的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，水稻OsGSTU30和OsGSTU41基因的大量表達(dá)在不影響酵母在正常生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)的情況下，可以通過較高的GST 活性提高菌體對(duì)重金屬Cr（VI）的抗性[25]。因此，研究結(jié)果說明了BvGST 是能源甜菜體內(nèi)重要的解毒酶之一，通過其在酵母體內(nèi)與Cd 逆境脅迫中的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的研究，確定其在重金屬逆境功能機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，該基因的克隆也為下一步深入細(xì)致地研究其在重金屬逆境脅迫下的組織表達(dá)特性和缺失突變體的獲得奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過克隆和酵母菌體外重組表達(dá)目的基因BvGST，發(fā)現(xiàn)該基因可以在一定程度上提高宿主菌在重金屬Cd逆境下的生存狀態(tài)和生長(zhǎng)趨勢(shì)。能源甜菜BvGST基因與鎘逆境脅迫之間存在著一定的應(yīng)答關(guān)系，該基因可能通過直接或間接的作用降低Cd對(duì)細(xì)胞的毒害，從而提高酵母對(duì)重金屬的耐受性。研究結(jié)果也為進(jìn)一步對(duì)BvGST基因的功能開發(fā)和利用生物技術(shù)改造人工超累積能源甜菜奠定基礎(chǔ)。