QuCHERS-UHPLC-MS/MS法測(cè)定畜中雙氯芬酸鈉殘留量

王乾麗，毛敏霞，黃永橋，馬凱，陶光燦，李占彬*

貴州省分析測(cè)試研究院（貴陽(yáng) 550014）

雙氯芬酸鈉（Diclofenac sodium）為非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥，屬苯乙酸類衍生物，主要通過(guò)抑制環(huán)氧合酶減少前列腺素的合成從而起到抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱的作用[1-3]。近年來(lái)，雙氯芬酸鈉在臨床上被廣泛使用，該藥物的安全問(wèn)題也越來(lái)越受到關(guān)注，如造成腎臟、肝臟及坯胎等損害的不良反應(yīng)[4-5]。雙氯芬酸鈉在畜禽養(yǎng)殖中主要用于動(dòng)物關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)痛引起的發(fā)熱、炎癥等，能改善肉雞的腿瘸和蛋雞的斷喙性能，但是該藥物對(duì)禽類有較大毒性，歐盟已經(jīng)批準(zhǔn)雙氯芬酸鈉可以用于豬和牛，并制定了其最大殘留限量（MRLs），在國(guó)內(nèi)尚未批準(zhǔn)用于動(dòng)物，也未制定相關(guān)最大殘留限量[6-7]。2005年，山東省藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心將雙氯芬酸等19種非甾體抗炎藥列為不良反應(yīng)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)品種，以加強(qiáng)安全性監(jiān)測(cè)[8]。

目前，針對(duì)雙氯芬酸鈉的分析檢測(cè)，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布SN/T 2190—2008《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中非甾體類抗炎藥殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[9]，文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-18]。這些方法樣品前處理過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且目標(biāo)物損失較多，很難滿足快速篩查的要求；而QuEChERS法作為一種樣品前處理快速凈化方法，未見應(yīng)用于畜肉中雙氯芬酸鈉殘留量的檢測(cè)分析中。此次試驗(yàn)基于QuEChERS技術(shù)對(duì)藥品進(jìn)行前處理，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析手段建立畜肉中雙氯芬酸鈉殘留的檢測(cè)方法，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度和精密度好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量樣品的快速分析檢測(cè)，為企業(yè)和食品安全監(jiān)管部門提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和試劑

1.1.1 主要儀器與設(shè)備

Agilent 1290 超高效液相色譜儀、Agilent 6470 QQQ三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜，配有ESI源（美國(guó)Agilent公司）；攪拌機(jī)Blixer3（法國(guó)ROBOT COUPA公司）；LT2002電子天平（常熟市天量?jī)x器有限公司）；UMV-2多管渦旋混合器（北京普立泰科儀器有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；陶瓷均質(zhì)子（迪馬科技有限公司）；十八烷基鍵合硅膠（C18）吸附劑（上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；無(wú)水硫酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；0.22 μm PTFE濾膜（上海安普）。

1.1.2 主要試劑

甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙酸乙酯（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；乙酸銨（分析純、西亞試劑）；雙氯芬酸鈉（純度＞99%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取10 mg雙氯芬酸鈉（精確至0.000 1 g）于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃避光保存6個(gè)月。移取100.0 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取100.0 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3 色譜條件

色譜柱，ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent公司）；流動(dòng)相A，0.1%甲酸水溶液，B，乙腈；流速，0.3 mL/min；柱溫，40 ℃；進(jìn)樣體積，2.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度

1.4 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓，4.5 kV；霧化器壓力，45 psi；干燥氣流速，10 L/min；干燥氣溫度，300 ℃；鞘氣流速，10 L/min；鞘氣溫度，300 ℃；其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 其他質(zhì)譜條件

1.5 樣品前處理

稱取5.00 g搗碎后的組織樣品于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，加入1粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩10 min，以4 500 r/min常溫離心10 min，吸取2 mL上清液于15 mL離心管中，加入900 mg無(wú)水硫酸鈉和100 mg C18吸附劑，渦旋1 min，以5 000 r/min離心2 min，取上清液過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，待測(cè)。

1.6 基質(zhì)工作曲線配制

依次吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)使用液加入相同取樣量的3種空白基質(zhì)樣品中（牛肉、羊肉、豬肉），樣品按1.5小節(jié)的方法處理后得到3種基質(zhì)工作曲線，分別對(duì)3種樣品進(jìn)行定量校正。雙氯芬酸鈉的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍為0.25～10.00 ng/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取

選用空白豬肉、牛肉、羊肉陰性樣品，分別考察了乙腈、0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸乙酸乙酯的提取效率，結(jié)果見圖1。3種畜肉基質(zhì)中乙腈和0.1%甲酸乙腈的提取效果優(yōu)于乙酸乙酯和0.1%甲酸乙酸乙酯的提取效果，且乙腈的提取效果好于0.1%甲酸乙腈，因此選擇乙腈作為樣品提取溶劑。

試驗(yàn)對(duì)渦旋振蕩提取的時(shí)間（5，10和15 min）進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5～10 min時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取效果明顯增大，10 min以后隨著時(shí)間的增加，提取效果基本趨于穩(wěn)定，故選用渦旋振蕩10 min作為樣品提取時(shí)間。

圖1 不同提取溶劑回收率比較

2.1.2 凈化

目前，除了市售已有的產(chǎn)品，常用的吸附劑有C18、PSA、GCB等。此次試驗(yàn)對(duì)QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管（美國(guó)Agilent公司）、Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（美國(guó)Waters公司，無(wú)需活化及淋洗、上樣直接收集濾液）及C18吸附劑進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，使用QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管和Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化時(shí)，目標(biāo)物基本被填料完全吸附；使用C18吸附劑凈化時(shí)，目標(biāo)物損失較少。試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)C18粉的用量（50，100和200 mg）進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，使用100 mg C18粉凈化樣品時(shí)，凈化效果較好，且目標(biāo)物損失較少。

為加強(qiáng)樣品凈化效果，試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)PSA吸附劑的用量（50，100和200 mg）進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用PSA吸附劑時(shí)樣品凈化效果更好，但是PSA吸附劑對(duì)雙氯芬酸鈉有較強(qiáng)的吸附，導(dǎo)致雙氯芬酸鈉的損失較大，故試驗(yàn)選擇不加入PSA吸附劑。此次試驗(yàn)還對(duì)無(wú)水硫酸鈉的用量進(jìn)行了考察，最終確定使用900 mg無(wú)水硫酸鈉。綜合考慮，使用900 mg無(wú)水硫酸鈉和100 mg C18吸附劑作為樣品前處理方法。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸銨溶液等不同洗脫體系對(duì)目標(biāo)物分離能力。結(jié)果表明，使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物有良好的色譜分離效果，色譜峰峰型更好，且有較好的響應(yīng)值，進(jìn)一步對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，目標(biāo)物有較好的分離，縮短樣品分析時(shí)間，提高分析效率；試驗(yàn)考察了25，30，40和50 ℃不同柱溫對(duì)目標(biāo)物的影響，結(jié)果表明采用40 ℃的柱溫時(shí)目標(biāo)物有較好的響應(yīng)值，從而確立了最佳色譜條件，樣品單次分析時(shí)間僅需3.5 min，滿足大批樣品的快速檢測(cè)分析。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)雙氯芬酸鈉含有羧基的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可在酸性條件下得到H+而形成較為穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子，在正離子模式下一級(jí)全掃描質(zhì)譜得到分子離子峰（[M+H]+，296.1），通過(guò)優(yōu)化錐孔電壓，對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到子離子特征碎片質(zhì)譜圖，選擇特征碎片中離子中響應(yīng)值高、基線噪聲低的離子對(duì)作為定性離子對(duì)，選擇響應(yīng)值最高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，優(yōu)化子離子對(duì)碰撞能量，使其豐度最大；進(jìn)一步優(yōu)化毛細(xì)管電壓、霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度及壓力等質(zhì)譜參數(shù)，使其離子化效率最佳，得到最優(yōu)的質(zhì)譜條件。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)及消除

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在進(jìn)行離子化時(shí)相互競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致目標(biāo)化合物信號(hào)強(qiáng)度有不同程度的增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。盡管樣品經(jīng)過(guò)沉淀蛋白、分散固相萃取后取得了良好的凈化效果，但仍無(wú)法完全消除基質(zhì)效應(yīng)，而基質(zhì)效應(yīng)的存在會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。因而在建立UHPLC-MS/MS檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，采取措施消除或減弱其影響是非常必要的。

采用空白樣品處理液加標(biāo)曲線法（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線）評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，即基質(zhì)效應(yīng)ME=（基質(zhì)配標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率/無(wú)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率-1）×100%[19]，負(fù)值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，正值表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。從表3可以看出雙氯芬酸鈉在豬肉、羊肉、牛肉中均存在基質(zhì)效應(yīng)，且均為基質(zhì)抑制效應(yīng)，抑制效應(yīng)較大。

表3 雙氯芬酸鈉的基質(zhì)效應(yīng)

2.4.2 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限

采用基質(zhì)工作曲線作為定量曲線。選取豬肉、牛肉和羊肉3種陰性樣品，吸取不同量的標(biāo)準(zhǔn)使用液加入3種空白樣品中，按照1.5小節(jié)的方法處理后經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子對(duì)峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X，μg/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3種基質(zhì)的工作曲線。結(jié)果表明，雙氯芬酸鈉在0.25～10.00 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.996以上，適用于定量分析。通過(guò)向陰性樣品中添加目標(biāo)物來(lái)考察方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），最終確定方法的檢出限（LOD）為0.5 μg/kg，定量限（LOQ）為1.5 μg/kg，結(jié)果見表4，說(shuō)明該方法具有較好的靈敏度。

表4 雙氯芬酸鈉的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）

2.5 加標(biāo)回收及精密度考察

選取豬肉、牛肉和羊肉陰性樣品，分別添加0.5，1和2 μg/kg 3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行試驗(yàn)，按照1.5小節(jié)的方法進(jìn)行提取凈化，3個(gè)加標(biāo)濃度連續(xù)做3 d，分別計(jì)算精密度，精密度以變異系數(shù)（CV）表示。標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和加標(biāo)樣品見圖2，結(jié)果如表5所示。3個(gè)添加水平的日內(nèi)平均回收率分別為：豬肉86.9%～93.3%，牛肉90.9%～99.0%和羊肉87.3%～96.1%；日內(nèi)變異系數(shù)（CV）分別為：豬肉2.3%～4.8%，牛肉5.1%～5.8%和羊肉4.4%～5.2%；日間平均回收率分別為：豬肉89.6%～94.1%，牛肉87.7%～96.1%和羊肉88.1%～94.9%；日間變異系數(shù)（CV）分別為：豬肉2.1%～9.0%，牛肉3.7%～8.2%和羊肉2.1%～4.0%。結(jié)果表明，該方法具有較好的重復(fù)性與準(zhǔn)確性，能夠滿足豬肉、牛肉、羊肉樣品中雙氯芬酸鈉殘留量的測(cè)定。

圖2 MRM色譜圖

表5 畜肉中雙氯芬酸鈉的添加回收率和精密度

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

選取了50個(gè)批次的市售豬肉樣品、20個(gè)批次的市售牛肉樣品和10個(gè)批次的市售羊肉樣品，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，按此次試驗(yàn)建立的方法進(jìn)行測(cè)定，其中有3份豬肉樣品和1份牛肉樣品雙氯芬酸鈉檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，豬肉檢測(cè)結(jié)果分別為3.04，9.43和19.27 μg/kg，牛肉檢測(cè)結(jié)果為6.65 μg/kg，其余樣品均未檢出。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了豬肉、牛肉、羊肉中雙氯芬酸鈉殘留量的快速檢測(cè)方法，對(duì)樣品前處理、液相色譜、質(zhì)譜等條件進(jìn)行優(yōu)化，樣品用乙腈提取劑，經(jīng)QuEChERS試劑凈化。結(jié)果表明，雙氯芬酸鈉在3.5 min內(nèi)完成分析，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.996以上，檢出限為0.5 μg/kg；在0.5，1和2 μg/kg 3個(gè)添加水平的日內(nèi)平均回收率分別為：豬肉86.9%～93.3%，牛肉90.9%～99.0%和羊肉87.3%～96.1%；日內(nèi)變異系數(shù)（CV）分別為：豬肉2.3%～4.8%，牛肉5.1%～5.8%和羊肉4.4%～5.2%；日間平均回收率分別為：豬肉89.6%～94.1%，牛肉87.7%～96.1%和羊肉88.1%～94.9%；日間變異系數(shù)（CV）分別為：豬肉2.1%～9.0%，牛肉3.7%～8.2%和羊肉2.1%～4.0%。該方法操作簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，回收率高，靈敏度和重現(xiàn)性好，能夠準(zhǔn)確定性和定量雙氯芬酸鈉，為豬肉、牛肉、羊肉中雙氯芬酸鈉殘留量的檢測(cè)提供技術(shù)支撐，為監(jiān)管部門及食品安全提供更多的理論依據(jù)。