不同種質(zhì)黃果枸杞黃酮組分差異性

李越鯤，梁曉婕，王亞軍，祿璐，周旋

寧夏農(nóng)林科學(xué)院，枸杞工程技術(shù)研究所（銀川 750002）

枸杞系茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium L.）多年生落葉灌木，全球約有80種，中國作為枸杞的主要起源中心，自然分布枸杞屬植物共有7種3變種[1]。其中黃果枸杞（Lycium barbarum L. var. Auranticarpum K. F. Ching）是寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的變種[2]，其果實(shí)獨(dú)特、色澤鮮亮、鮮食細(xì)膩、口感好，具有可觀的市場前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但目前對黃果枸杞主要營養(yǎng)成分的提取與鑒定、深加工產(chǎn)品研發(fā)等方面的研究還處于起始階段。

黃酮類化合物是枸杞的功效成分之一，具有明顯的抗氧化、清除自由基、提高免疫力等作用[3-4]。課題組前期的研究結(jié)果表明黃果枸杞具有高黃酮的特性[5-6]。但對于不同黃果枸杞種質(zhì)材料中黃酮類化合物的組分及含量仍不清楚。目前，對于枸杞中黃酮類化合物的測定方法已經(jīng)成熟，常用的方法包括紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、熒光分光光度法等[7-10]，為黃果枸杞黃酮類化合物的提取及應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

試驗(yàn)采用的超高效液相色譜-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀是可以同時(shí)定量和定性的分析系統(tǒng)，具有高分辨、高靈敏度等技術(shù)特點(diǎn)，用該檢測系統(tǒng)對具有代表性的7份黃果枸杞種質(zhì)材料進(jìn)行黃酮組分的測定，為黃酮組分及其含量數(shù)據(jù)的精確性提供了有效保證。此外，對7份材料的黃酮組分及含量進(jìn)行差異性比較分析，為黃果枸杞的開發(fā)利用及深加工產(chǎn)品的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采樣地概況

采樣地位于寧夏銀川市蘆花臺(tái)園林場枸杞種質(zhì)資源圃試驗(yàn)區(qū)，地理位置為106°09′10″E，38°38′49″N，海拔1 114 m，年均溫10 ℃左右，年平均降水量180 mm，全年平均日照時(shí)數(shù)超過3 000 h，0～30 cm土層的pH為7.90，全鹽含量為0.72 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量為9.46 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料為寧農(nóng)杞5號（原編號W-12-30）、寧農(nóng)杞4號（原編號W-13-29）、W-13-26、HZ-13-01、寧夏黃果、W-11-14和W-H-15-03共計(jì)7份黃果枸杞種質(zhì)材料，樹齡相同，栽培及田間管理方式一致，于2019年7月采集同一批新鮮的、無病蟲害的果實(shí)作為供試樣品。

1.3 試驗(yàn)方法

采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定黃果枸杞鮮果中的黃酮類活性成分。

1.3.1 供試品制備方法

取2 g打碎凍干的枸杞果實(shí)樣品于10 mL離心管中，加入5 mL 50%甲醇水溶液，混合均勻后放入超聲儀內(nèi)35 ℃超聲40 min，然后靜置5 min，取上清液于1 mL離心管中，放入高速離心機(jī)中，以1 300 r/min離心10 min，過0.22 um微孔濾膜后裝入1.5 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶內(nèi)，得到枸杞果實(shí)提取物。同樣條件得到空白對照品。將樣品放入4 ℃冰箱保存，在分析前取出（保存時(shí)間不能超過24 h）。

1.3.2 色譜條件

色譜儀器為島津LC-30A。色譜柱為C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫為35 ℃；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；流動(dòng)相采用乙腈-0.1%甲酸水溶液的梯度洗脫程序，具體見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀器為AB Sciex Triple TOF 5600+。

離子化模式為電噴霧正離子模式，離子源電壓分別為5 500 V，離子源溫度為600 ℃，去簇電壓（DP）分別為100 V，碰撞能量（CE）分別為35 eV，碰撞能量擴(kuò)展（CES）分別為15 eV。霧化氣體為氮?dú)?，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000，IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的6個(gè)最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。

離子化模式為電噴霧負(fù)離子模式，離子源電壓分別為-4 500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓（DP）分別為100 V，碰撞能量（CE）分別為-35 eV，碰撞能量擴(kuò)展（CES）分別為15 eV。霧化氣體為氮?dú)?，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000，IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的6個(gè)最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007軟件和SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃果枸杞果實(shí)中黃酮組分種類

通過建立4 176種黃酮類活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，采用飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜對數(shù)據(jù)庫中的活性成分匹配，定性分析枸杞果實(shí)中的黃酮類活性成分。樣品溶液正、負(fù)離子模式下的總離子流圖如圖1和圖2所示。

黃果枸杞果實(shí)提取物正負(fù)離子模式下檢測到7大類共計(jì)42種活性成分，按每個(gè)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行定量，由高到低排序依次為去甲丁香色原酮、蘆丁、槲皮素、異黃酮素、苦參醇I、異槲皮苷、6-甲氧基山柰酚-3-O-蕓香糖苷、茵陳色原酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、鳶尾黃素-7-O-木糖基葡萄糖苷、異水飛薊賓、沒食子兒茶素、苦參醇F、柳杉雙黃酮A、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、落新婦苷、木犀草素、草質(zhì)素、水飛薊賓、去甲升麻素、4-羥基香豆素、二氫楊梅素、二氫桑色素、飛燕草素半乳糖苷、黃酮榕堿、葛根素-6’’-O-木糖苷、麥芽酚、光甘草酮、山奈酚、鬼臼毒醇、4’-O-甲基葛根素、木樨草素3’，7-二-O-葡糖苷酸、槲皮苷、2’’-O-p-香豆?；登G素、桑根酮C、槲皮素-3-龍膽二糖苷、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、Corylifol A、二氫槲皮素、楊梅素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、（+）-沒食子兒茶素。

2.2 黃果枸杞果實(shí)中黃酮組分差異性比較

從表2可以看出，7個(gè)品種（系）的黃果枸杞共檢測出了5種黃酮組分，且不同品種（系）的含量互相之間存在差異。其中僅有寧夏黃果枸杞果實(shí)中含有黃酮榕堿這一成分，其它品種（系）的黃果枸杞果實(shí)中均不包含。此外，寧農(nóng)杞4號枸杞果實(shí)中的木犀草素、木樨草素 3’，7-二-O-葡糖苷酸和2’’-O-p-香豆?；登G素的含量均為最大，分別為1.32%，0.69%和0.63%，與其他品種（系）之間存在顯著差異（p＜0.05）；W-13-26枸杞果實(shí)中的柳杉雙黃酮A含量顯著高于其他黃果枸杞品種（系）的含量（p＜0.05）。

圖1 枸杞果實(shí)提取物正離子模式下與空白對照總離子流圖

圖2 枸杞果實(shí)提取物負(fù)離子模式下與空白對照總離子流圖

表2 不同種質(zhì)黃果枸杞黃酮組分差異

從表3可以看出，7個(gè)品種（系）的黃果枸杞共檢測出了14種黃酮醇組分，且不同品種（系）的含量互相之間存在差異。其中異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、草質(zhì)素以及槲皮素-3-龍膽二糖苷的含量在7個(gè)品種（系）的黃果枸杞之間不具有顯著差異（p＞0.05），其它組分在品種間均具有差異。寧農(nóng)杞4號在異水飛薊賓、山奈酚、槲皮苷、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷以及槲皮素-7-O-葡萄糖苷5種含量上均顯著高于其它品種（系）黃果枸杞果實(shí)的含量（p＜0.05），顯示出了明顯的優(yōu)越性；W-13-26在異槲皮苷、6-甲氧基山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水飛薊賓含量方面顯著大于其他品種（系）的黃果枸杞；寧夏黃果中蘆丁及槲皮素含量顯著高于其他品種（系）（p＜0.05），寧農(nóng)杞5號中楊梅素的含量顯著高于其它品種（系）（p＜0.05）。

從表4可以看出，7個(gè)品種（系）的黃果枸杞共檢測出了6種異黃酮組分。其中光甘草酮含量互相之間不存在顯著差異（p＞0.05），但僅有寧農(nóng)杞5號、寧農(nóng)杞4號和寧夏黃果三個(gè)品種果實(shí)中含有該組分，其余黃果枸杞品種（系）中未檢出該成分。葛根素-6’’-O-木糖苷在寧農(nóng)杞5號及W-11-14枸杞果實(shí)中的含量較高，在W-H-15-03枸杞果實(shí)中的含量較低，同樣在其余黃果枸杞品種（系）中未檢出。其余4種異黃酮組分中，寧農(nóng)杞4號果實(shí)中的異黃酮素含量最高（8.26%），W-H-15-03果實(shí)中的4’-O-甲基葛根素含量最高（0.66%），寧農(nóng)杞5號果實(shí)中的Corylifol A含量最高（0.48%），而鳶尾黃素-7-O-木糖基葡萄糖苷在除W-13-26枸杞果實(shí)中的其他品種枸杞果實(shí)中的含量基本上相同，且不具有顯著差異（p＞0.05）。

從表5可以看出，7個(gè)品種（系）的黃果枸杞共檢測出了7種二氫黃酮醇組分。其中二氫桑色素含量在7個(gè)枸杞品種（系）中不存在顯著差異（p＞0.05），而其他6種組分在品種（系）間均存在差異。苦參醇I、苦參醇F、落新婦苷、二氫楊梅素C15H12O8及桑根酮C的含量分別在W-13-26、HZ-13-01、W-13-26、W-11-14及寧農(nóng)杞4號枸杞果實(shí)中最高，二氫楊梅素的含量則在寧農(nóng)杞5號、HZ-13-01及W-11-14中最高，且彼此之間不存在顯著性差異。

表3 不同種質(zhì)黃果枸杞黃酮醇組分差異

表4 不同種質(zhì)黃果枸杞異黃酮組分差異

表5 不同種質(zhì)黃果枸杞二氫黃酮醇組分差異

從表6可以看出，7個(gè)品種（系）的黃果枸杞共檢測出了1種二氫黃酮醇組分，即補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚，其中W-13-26枸杞果實(shí)中的含量顯著高于其他枸杞品種系（3.41%）（p＜0.05），其他品種系枸杞果實(shí)中的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚含量不存在顯著差異（p＞0.05）。在黃烷醇方面，7個(gè)品種（系）的黃果枸杞共檢測出了3種組分，分別是沒食子兒茶素、飛燕草素半乳糖苷及（+）-沒食子兒茶素。其中（+）-沒食子兒茶素這一組分僅存在于寧夏黃果中（0.40%），其他黃果枸杞品種（系）中不存在該成分；飛燕草素半乳糖苷這一成分在7種黃果枸杞品種（系）中不存在顯著差異；在沒食子兒茶素含量方面，僅W-13-26黃果品系顯著低于其他黃果枸杞品種（系）（p＜0.05），其他6個(gè)品種（系）的黃果枸杞中該含量互相之間不具有顯著差異（p＞0.05）。

從表7可以看出，7個(gè)品種（系）的黃果枸杞共檢測出了6種類黃酮的其他物質(zhì)，其中僅有2種物質(zhì)（去甲丁香色原酮、去甲升麻素）在7份黃果枸杞材料中均有檢出，其它檢出物質(zhì)中茵陳色原酮僅存在于寧夏黃果和W-11-14枸杞果實(shí)中，且互相之間不存在顯著差異（p＞0.05）；4-羥基香豆素存在于寧農(nóng)杞4號、W-13-26、HZ-13-01及W-H-15-03四個(gè)黃果枸杞品種（系）中，且寧農(nóng)杞4號枸杞果實(shí)中的含量（1.32%）顯著高于其他品種（系）；麥芽酚及鬼臼毒醇則分別在寧農(nóng)杞5號（0.76%）及寧農(nóng)杞4號（0.92%）枸杞果實(shí)中含量最高。

表6 不同種質(zhì)黃果枸杞二氫黃酮及黃烷醇組分差異

表7 不同種質(zhì)黃果枸杞其他物質(zhì)差異

3 結(jié)論

首次采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對7份黃果枸杞種質(zhì)材料的黃酮組分進(jìn)行了測定，并對各組分含量進(jìn)行了差異性分析。結(jié)果表明：黃果枸杞含有7大類42個(gè)黃酮組分；其中23個(gè)是7份黃果枸杞材料共有的，19個(gè)組分僅存在于個(gè)別黃果枸杞材料中；在種類方面，寧夏黃果中黃酮組分最多，為35種，且黃酮榕堿和（+）-沒食子兒茶素為其獨(dú)有；在含量方面，寧農(nóng)杞4號表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢，有16種組分均顯著高于其他黃果枸杞材料（p＜0.05）。此次試驗(yàn)明確了有代表性的黃果枸杞種質(zhì)材料中黃酮的組成特性，為進(jìn)一步研究黃果枸杞黃酮類化合物的活性及深加工產(chǎn)品的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。