硝酸銀-硅膠柱層析法分離純化華山松籽油亞油酸

郭劍霞，張謹(jǐn)華，潘玉峰

晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（晉中 030619）

華山松（Pinus armandi Franch）是中國特有樹種，其籽平均含油率為56.5%，其中亞油酸含量最高，達(dá)57.7%。亞油酸是重要的功能性多不飽和脂肪酸，具有許多重要的生理功能[1-2]。亞油酸能降低血液膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。高純度亞油酸是人和動(dòng)物營養(yǎng)中必需的脂肪酸，具有降血脂及防治心腦血管疾病等功能。但人體不能合成亞油酸，只能從油脂中獲得[3-4]。

用于多不飽和脂肪酸（PUFAs）分離純化的主要方法有超臨界流體精餾法[5]、分子蒸餾法[6]、尿素包合法[7]、銀離子配位法[8]、吸附分離法等[9]。其中吸附分離法中的硝酸銀-硅膠柱法具有操作方便、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)。尤其對碳鏈數(shù)目相近的不飽和脂肪酸分離效果甚為明顯[10]。

硝酸銀-硅膠柱層析色譜分離法常用于多不飽和脂肪酸及其甲酯的分離純化[11]。硅膠層析時(shí)加入硝酸銀后可以改變硅膠表面的吸附性能，增大層析分辨率，提高分離效果。由于吸附在硅膠上的銀離子與不飽和脂肪酸分子中的—C＝C—之間發(fā)生電子遷移形成π絡(luò)合物，從而改變了各飽和度不同的脂肪酸在吸附劑（硝酸銀-硅膠）上的分配系數(shù)，使之得以分離[12]。

試驗(yàn)以硝酸銀-硅膠H為吸附劑，探究硝酸銀-硅膠柱層析法中重要因素對華山松籽油中亞油酸分離純化的影響，為從華山松籽油中分離亞油酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

華山松籽仁（吉林省派諾生物技術(shù)有限公司，經(jīng)超臨界CO2萃取制得華山松籽油）。

無水硫酸鈉、95%乙醇、石油醚（沸程30～60℃）、丙酮、甲醇、硫酸、氫氧化鉀、鹽酸等（均為分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（色譜純）；混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.5%，美國Sigma公司）。

HA 221-50-06超臨界萃取裝置；RE-5203A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；PHS-3 C型酸度計(jì)；日本島津GC2010氣相色譜儀，配備火焰離子化檢測器（FID）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 華山松籽油混合脂肪酸（PFA）的制備

參考文獻(xiàn)[13]中的方法。稱取50.0 g華山松籽油于燒瓶中，加入200 mL 4%氫氧化鉀-95%乙醇溶液，用磁力攪拌器緩慢攪拌升溫至75 ℃，皂化回流2 h至皂化完全。加入一定量溫水，繼續(xù)攪拌30 min使其皂化物充分溶解，在反應(yīng)液中緩慢加入20%鹽酸調(diào)節(jié)約pH 2，繼續(xù)恒溫?cái)嚢?5 min，分液漏斗分出油層，加入適量石油醚溶解，并用溫水洗滌有機(jī)層至中性，加入適量無水硫酸鈉脫水，過濾，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得脂肪酸混合液（PFA），稱其質(zhì)量。

1.2.2 硅膠預(yù)處理

將硅膠經(jīng)110 ℃ 烘20 h活化，在正己烷中浸泡24 h，經(jīng)超聲波脫氣后用于柱層析。

1.2.3 硝酸銀硅膠的制備

參照文獻(xiàn)[14]的方法，稍作修改。稱取20.0 g活化后硅膠，加入6.0 g硝酸銀、20 mL蒸餾水和30 mL 95%乙醇，劇烈振蕩。將混合液轉(zhuǎn)移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)燒瓶中（瓶用鋁箔包裹），在70 ℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后形成流動(dòng)樣粉末，停止蒸發(fā)。將所制得硝酸銀硅膠于110 ℃烘20 h以上，即為層析用硝酸銀硅膠。

1.2.4 銀化硅膠對脂肪酸的吸附動(dòng)力學(xué)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[14]的方法。準(zhǔn)確稱取0.25 g硝酸銀硅膠，加入60 mL質(zhì)量濃度55 mg/mL的PFA-正己烷溶液中，25 ℃下避光恒溫?cái)嚢瑁扛?.5 h測定一次上清液中的總脂肪酸質(zhì)量濃度（mg/mL）。分析混合脂肪酸吸附量隨時(shí)間變化趨勢，得到混合脂肪酸的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，同時(shí)計(jì)算相應(yīng)間隔時(shí)間內(nèi)混合脂肪酸的平均吸附速率?？傊舅釢舛鹊臏y定參考GB/T 5530—2006。

1.2.5 裝柱

選用層析柱規(guī)格（35 cm×1.8 cm），分離效果以洗脫液中亞油酸相對百分含量為指標(biāo)。稱取12.0 g活化后的硝酸銀硅膠，加入80 mL正己烷，攪拌，排除氣泡，靜置2 h，使硅膠充分溶脹。勻漿法裝柱。在層析柱底部預(yù)先放入脫脂棉，加入20 mL正己烷，將溶脹的銀化硅膠緩慢傾入，柱外用錫紙包裹，裝完后墊上一層濾紙，加適量無水硫酸鈉，打開旋塞，用正己烷洗柱平衡2 h后使用。

將層析柱中多余正己烷從柱底排出，待層析柱內(nèi)液面略高于硅膠面0.5 cm時(shí)開始上樣。在硅膠面上放一塊濾紙以防止加樣時(shí)沖壞上樣面。將一定質(zhì)量PFA溶解到5 mL洗脫溶劑中，上樣，用滴管緩慢滴加到層析柱內(nèi)，注意不要使硅膠面有浮動(dòng)。進(jìn)行洗脫，定體積收集洗脫液。

1.2.7 洗脫

經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)，確定洗脫體系為含有丙酮的正己烷混合液，按照丙酮在正己烷中的濃度分別為0%，3%，5%，7%，9%（洗脫2次）和11%（洗脫2次）順序進(jìn)行洗脫，其中每一濃度100 mL，以0.8～1.0 mL/min洗脫流速進(jìn)行梯度洗脫，每40 mL收集液為1個(gè)樣品，按收集順序編號。

1.2.8 脂肪酸回收

洗脫液每40 mL收集1管，將收集到的各流分按先后順序依次編號，旋蒸除去洗脫劑，用2 mL正己烷溶解，加入適量飽和NaCl水溶液，振搖1 min，靜置分層，除去下層殘?jiān)奥然y沉淀與廢液，取有機(jī)相通過裝有無水硫酸鈉的漏斗，濾液于60 ℃水浴中減壓回收溶劑，即得脂肪酸樣品。密封置棕色瓶中-20 ℃保存，用于氣相色譜分析。

1.2.9 氣相色譜分析

1.2.9.1 脂肪酸甲酯的制備

為進(jìn)行氣相色譜分析，需要對脂肪酸進(jìn)行甲酯化處理，甲酯化的目的主要是為減少分子間形成氫鍵，同時(shí)減少分子的極性，使其更容易氣化，從而縮短分析時(shí)間，也保證峰與峰之間有效的分離度。在燒瓶中稱取0.1 g脂肪酸樣品，70 ℃水浴鍋中甲酯化30 min，同時(shí)加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液。后加入2 mL異辛烷，加入蒸餾水至瓶頸口，靜置分層，選取異辛烷層進(jìn)行氣相色譜分析。

“擺譜”，源自東北話。19世紀(jì)初期，東北移民屯墾時(shí)，老輩人家都有家譜，大家常坐到一塊“擺譜”，看看誰家的“譜大”，出身顯赫，有傲人資本。后來，“擺譜”引申為故意擺出某種姿態(tài)顯示給別人看。譬如擺門面，擺架子，擺陣勢，無非是證明自己是名人、顯貴、闊佬，以滿足可憐且可笑的虛榮心。

1.2.9.2 分析方法

氣相色譜儀分析脂肪酸甲酯。分析條件為：PEG-2M毛細(xì)管柱，0.31 mm×25 m；柱溫190 ℃；檢測器溫度250 ℃；氣化室溫度250 ℃；載氣N2；流速37 mL/min；氫氣25 mL/min；空氣100 mL/min；進(jìn)樣量0.5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 上樣量對華山松籽油亞油酸分離純化效果的影響

上樣量直接影響層析柱的分離性能，樣品過載程度過大，會(huì)嚴(yán)重降低分離效率，甚至使色譜柱失去分離能力；上樣量不足，樣液濃度低，擴(kuò)散作用大，也可造成分離效率低[15]。研究不同上樣量對多不飽和脂肪酸純度的影響，其結(jié)果如圖1所示。使用35 cm×1.8 cm的層析柱，按照脂肪酸與吸附劑的質(zhì)量比分別為1∶8，1∶15和1∶30上樣進(jìn)行洗脫，繪制PUFAs亞油酸的洗脫曲線，收集洗脫下來的亞油酸，測定其純度，結(jié)果如圖1所示。

上樣量分別選取1∶8，1∶15和1∶30（脂肪酸與吸附劑的質(zhì)量比）進(jìn)行洗脫，繪制不同上樣量的洗脫曲線。從圖1可以看出，上樣量與吸附劑質(zhì)量比1∶8時(shí)，色譜柱過載，所得流分中亞油酸的最高含量為87.02%，分離結(jié)果比較差。上樣量1∶30時(shí)，得到的亞油酸純度較高。但由于上樣量1∶30時(shí)上樣量太小，脂肪酸濃度太低，亞油酸與固定相結(jié)合緊密，需要大量洗脫液才能將其洗脫下來，分離效能下降。因此，就PFA的純化而言，確定PFA與吸附劑質(zhì)量比1∶15較佳（即上樣量0.8 g脂肪酸）?？紤]到試驗(yàn)要求和硝酸銀成本問題，最終選定上樣量與吸附劑質(zhì)量比1∶15。

圖1 上樣量對亞油酸含量的影響

2.2 不同濃度洗脫劑對華山松籽油亞油酸純度的影響

稱取12.0 g活化好的硝酸銀-硅膠，采用濕法填充于35 cm×1.8 cm玻璃柱中，錫箔紙包住玻璃柱避光以防止硝酸銀氧化分解。將0.8 g混合脂肪酸溶解到5 mL洗脫溶劑中，上樣，用不同體積分?jǐn)?shù)的丙酮-正己烷溶液依次洗脫，得到PFA分離產(chǎn)物。研究硝酸銀-硅膠柱層析純化華山松籽油亞油酸的洗脫結(jié)果，以丙酮-正己烷溶液作為洗脫劑，每40 mL收集1次組分，共得到11種組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去洗脫劑、水洗3次后加入無水硫酸鈉脫水，加正己烷復(fù)溶，利用氣相色譜檢測各部分流出液中脂肪酸的組成，結(jié)果如表1所示。

表1為利用不同體積比的丙酮-正己烷溶液作為色譜柱洗脫劑通過色譜柱分離提純后的脂肪酸種類。正己烷為非極性溶劑，對于飽和脂肪酸有較好的洗脫力，加入丙酮調(diào)節(jié)極性后，較適合亞油酸、油酸及亞麻酸等不飽和脂肪酸的徹底洗脫。正己烷具有洗脫飽和脂肪酸時(shí)速度快、洗脫效果徹底等優(yōu)勢[16]，洗脫體系中丙酮含量的多少對亞油酸和油酸的洗脫效果有明顯影響。以正己烷作為洗脫劑時(shí)，幾乎所有的不飽和脂肪酸（亞油酸、亞麻酸和油酸）均可被銀化硅膠吸附，只有少量飽和脂肪酸被吸附。這是因?yàn)椴伙柡椭舅嶂须p鍵數(shù)目越多，與Ag+結(jié)合力越強(qiáng)。同時(shí)，脂肪酸的極性也隨著雙鍵數(shù)目增加而增加，因此，按照相似相容的原理，增加洗脫劑的極性有助于將吸附在銀化硅膠上的PUFAs洗脫下來。洗脫液開始用0%（丙酮在正己烷中濃度）洗脫劑，隨后改變洗脫劑濃度，使丙酮在正己烷中濃度逐漸增加到3%，5%，7%，9%和11%繼續(xù)剩余不飽和脂肪酸的洗脫。

由于飽和脂肪酸（C16∶0、C18∶0和C20∶0）不含雙鍵，與固定相銀化硅膠結(jié)合力弱，這些脂肪酸用較多的非極性溶劑就可以大量被洗脫，因此，最先從層析柱中洗脫下來。數(shù)據(jù)顯示，不被銀離子吸附的棕櫚酸、硬脂酸和花生酸等飽和脂肪酸及少量未被吸附劑吸附的不飽和脂肪酸主要存在于正己烷相中。單不飽和脂肪酸油酸（C18∶1）能用稍大極性的洗脫劑洗脫。油酸主要被丙酮-正己烷（3%）洗脫。由于單不飽和脂肪酸含有一個(gè)雙鍵，與銀化硅膠的結(jié)合力稍強(qiáng)，增加洗脫劑的極性后開始被洗脫下來。亞油酸在最初洗脫時(shí)的數(shù)量很少，洗脫劑濃度為5%（丙酮在正己烷中的濃度）時(shí)純度明顯提高。隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)增加，溶劑洗脫體系極性增加，多不飽和脂肪酸在組分中的含量隨之增加。在整個(gè)洗脫過程中，棕櫚酸、硬脂酸和花生酸首先被洗脫下來，在40 mL流出液中棕櫚酸、硬脂酸和花生酸的含量達(dá)到28.10%，31.46%和38.31%。油酸和亞油酸的含量分別在200和440 mL中達(dá)到峰值，分別為74.22%和98.12%。由表1可知，棕櫚酸、硬脂酸和花生酸的洗脫趨勢相近，兩者在溶劑洗脫過程中被同時(shí)洗脫下來。油酸是影響硝酸銀-硅膠柱純化華山松籽油亞油酸效果的主要因素，如何提高油酸與亞油酸的分離度，是提高華山松籽油亞油酸純度的關(guān)鍵。

表1 硝酸銀-硅膠柱層析純化脂肪酸的洗脫結(jié)果（PFA與吸附劑質(zhì)量比1∶15）

圖2為不同濃度洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，以各樣品中的亞油酸相對含量（%）對流出液體積（mL）作混合脂肪酸與吸附劑質(zhì)量比1∶15時(shí)的洗脫曲線圖。

硝酸銀-硅膠柱層析分離多不飽和脂肪酸主要基于銀離子可以與—C＝C—形成絡(luò)合物，且雙鍵數(shù)越多，脂肪酸的極性越強(qiáng)，與銀離子的結(jié)合越牢固。不同極性的有機(jī)溶劑具有不同的洗脫能力，可將脂肪酸從硝酸銀-硅膠載體上洗脫下來[17]。試驗(yàn)用非極性溶劑正己烷將與銀化硅膠結(jié)合力較弱的飽和與部分單不飽和脂肪酸洗脫下來，接著在正己烷中加入一定量丙酮增加其極性，進(jìn)一步將PUFAs亞油酸洗脫下來并收集。

華山松籽油亞油酸在不同時(shí)期洗脫液中的含量變化如圖2所示。洗脫液體積160 mL時(shí)，亞油酸開始被洗脫下來，曲線呈上升趨勢；洗脫液體積440 mL時(shí)，亞麻酸全部被洗脫下來，洗脫液中亞麻酸含量98.12%。由于亞油酸有2個(gè)雙鍵，與銀化硅膠的結(jié)合力較強(qiáng)，較難被洗脫。飽和脂肪酸與銀化硅膠結(jié)合較弱，用非極性洗脫劑就可以被洗脫下來。為得到高純度的PUFAs亞油酸，利用銀化硅膠層析法可消除飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸油酸的影響，但需要增加洗脫劑的極性。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，5%丙酮-正己烷洗脫液可將大部分的亞油酸洗脫出來，因此，可先用0%，3%和5%丙酮正己烷洗脫，再用高含量的丙酮-正己烷洗脫液洗脫，減小試劑消耗。由于亞油酸有兩個(gè)雙鍵，吸附較強(qiáng)，最終被強(qiáng)極性的丙酮?jiǎng)冸x，9%丙酮-正己烷洗脫液將亞油酸全部洗脫下來。由皂化和酸解所得混合脂肪酸的亞油酸的得率為89.7%，亞油酸含量達(dá)到98.12%。試驗(yàn)表明硝酸銀-硅膠柱層析絡(luò)合分離具有選擇性。銀離子在凝膠上的負(fù)載也會(huì)影響溶質(zhì)的保留時(shí)間，因?yàn)樨?fù)載決定固體基質(zhì)上銀離子的表面密度，與洗脫劑極性共同作用，這樣就使得硝酸銀-硅膠柱層析絡(luò)合分離具有高選擇性[18]。

圖2 華山松籽油亞油酸洗脫曲線圖

2.3 洗脫液氣相色譜分析

由于樣品在氣相中傳遞速度快，因此，樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間可以瞬間達(dá)到平衡?？蛇x作固定相的物質(zhì)很多，因此，氣相色譜法分析速度快且分離效率高。采用12.0 g銀化硅膠裝柱，上樣0.8 g混合脂肪酸，依次用100 mL正己烷，濃度3%，5%，7%，9%和11%的丙酮-正己烷溶液各100 mL進(jìn)行洗脫。對分離后的脂肪酸組成進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果見圖3和圖4。

將硝酸銀硅膠柱對亞油酸的分離純化效果用氣相色譜法進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3，圖4和表2。由圖3和圖4可以看出，華山松籽油經(jīng)硝酸銀-硅膠柱分離純化，亞油酸純度得到提高，亞油酸與飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸得到有效分離。

Sajilata等[19]報(bào)道了銀離子可與烯烴形成絡(luò)合物，而且這個(gè)過程可逆。根據(jù)華山松籽油亞油酸中含有2個(gè)不飽和雙鍵的特點(diǎn)，選取硝酸銀-硅膠作為吸附劑，探討硝酸銀-硅膠柱層析分離純化亞油酸的效果，結(jié)果表明分離效果較理想。由于硝酸銀能與烯鍵的π電子相互作用，改變硅膠的吸附特性，因此，硝酸銀-硅膠對亞油酸的吸附力強(qiáng)于油酸和飽和脂肪酸。洗脫液中加入丙酮后，洗脫液極性相應(yīng)增加，將吸附較弱的棕櫚酸、硬脂酸及花生酸從硝酸銀-硅膠的表面活性中心上解吸下來，極性較強(qiáng)的溶劑逐漸將吸附稍強(qiáng)的油酸解吸，達(dá)到分離亞油酸和油酸目的。從表2可以看出，分離產(chǎn)物中亞油酸相對含量由原來的57.7%提高到98.12%。結(jié)果表明，采用分離純化工藝可獲得高純度亞油酸。

圖3 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖

圖4 華山松籽油亞油酸柱層析精制后色譜圖

表2 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品與柱色譜分離后樣品脂肪酸組成

2.4 PFA的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

溫度保持一定時(shí)，吸附量與時(shí)間的關(guān)系可以繪制出吸附動(dòng)力學(xué)曲線，它是描寫吸附過程最常用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。準(zhǔn)確稱取0.25 g銀化硅膠，加入60 mL質(zhì)量濃度為55 mg/mL的PFA-正己烷溶液，25 ℃恒溫避光振蕩，每隔0.5 h測定1次上清液中總脂肪酸濃度（mg/mL）及其中亞油酸的相對含量，分析PFA的吸附量隨時(shí)間變化趨勢，得到PFA的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，同時(shí)計(jì)算相應(yīng)間隔時(shí)間內(nèi)PFA的平均吸附速率（見圖5和圖6）。

硝酸銀-硅膠柱色譜是根據(jù)脂肪酸成分中雙鍵的多少和位置不同，與硝酸銀形成π絡(luò)合物難易程度和穩(wěn)定性的差別而進(jìn)行層析分離的。Snyder等[20]的研究結(jié)果表明，吸附過程受溶劑相中強(qiáng)溶劑濃度的影響，因此，可通過改變?nèi)軇┫嘟M成中強(qiáng)溶劑的濃度改變洗脫效果。油酸、亞油酸、亞麻酸為極性物質(zhì)，在硝酸銀-硅膠上的競爭吸附能力較強(qiáng)，根據(jù)溶質(zhì)和吸附劑的特性，選擇非極性溶劑正己烷和極性略強(qiáng)的丙酮組成混合洗脫液，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。

研究硝酸銀-硅膠的吸附特性及銀化硅膠對脂肪酸的平均吸附速率曲線，其結(jié)果如圖5和圖6所示。從PFA的吸附動(dòng)力學(xué)曲線（圖5）可以看出，隨著吸附時(shí)間延長，吸附量不斷地增加，約2.5 h后達(dá)到平衡，達(dá)到平衡時(shí)的吸附量為87.6 mg/g。銀化硅膠對PFA的平均吸附速率曲線（圖6）顯示，銀化硅膠對多不飽和脂肪酸的吸附性能良好，2.0 h即可達(dá)到吸附平衡。由于銀化硅膠對多不飽和脂肪酸具有良好的吸附性能，因此它可作為一種優(yōu)良的吸附劑，用來分離純化多不飽和脂肪酸。吸附速率在前2.0 h迅速降低，之后逐漸緩和，至平衡后，幾乎不再下降，基本符合單分子層吸附理論。吸附動(dòng)力學(xué)曲線大體上可分為5種類型[21]。華山松籽油混合脂肪酸在硝酸銀-硅膠上的平均吸附速率曲線是Langmuir型，表明華山松籽油混合脂肪酸在硝酸銀-硅膠上基本屬于單分子層吸附。Langmuir理論模型描述的是單分子層的理想吸附。該假定是基于固體表面均一，一個(gè)吸附位置只能吸附一個(gè)分子的被吸附組分，各組分分子的面積大小相同，形成一個(gè)二維的理想溶液，并假定吸附分子在吸附劑固體表面上各占一個(gè)吸附位置，它們之間沒有橫向相互作用。固體吸附劑在洗脫溶液中的吸附動(dòng)力學(xué)曲線普遍是Langmuir型[22]。

圖5 銀化硅膠對脂肪酸的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖6 銀化硅膠對脂肪酸的平均吸附速率曲線

3 結(jié)論

在硝酸銀-硅膠柱色譜法精制華山松籽油亞油酸的研究中，通過對銀化硅膠吸附特性的研究及柱分離曲線的繪制，確定硝酸銀-硅膠柱色譜分離純化PUFAs亞油酸的最佳條件。在12 g活化的銀化硅膠色譜柱中，加入與吸附劑比例1∶15的脂肪酸，以丙酮-正己烷作為洗脫劑，可以有效地將華山松籽油中亞油酸分離出來，洗脫液濃度9%時(shí)，洗脫完畢，洗脫液中亞油酸含量達(dá)到98.12%。銀離子硅膠柱色譜選擇性較高，與分離前華山松籽油中亞油酸相比，純度提高40.4%。硝酸銀化硅膠使華山松籽油中亞油酸的純度得到大幅提高，該方法簡單易行，可大規(guī)模分離純化亞油酸。因此，硝酸銀-硅膠柱層析法是一種較理想的分離純化亞油酸的方法。銀化硅膠對脂肪酸的吸附符合單分子層吸附理論。