野生大樹(shù)茶種質(zhì)資源的品質(zhì)指標(biāo)多樣性分析評(píng)鑒

劉亞兵，趙華富，喬大河，陳娟，陳翔，曹雨*

1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所（貴陽(yáng) 550006）；2. 習(xí)水仙緣紅有限公司（習(xí)水 564600）

大樹(shù)茶（學(xué)名：Camellia arborescens Chang et Yu）是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人文環(huán)境選擇下來(lái)的結(jié)果，主要分布在中國(guó)西南地區(qū)，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性、優(yōu)良的茶葉品質(zhì)及深厚的歷史文化底蘊(yùn)[1-2]。以大樹(shù)茶為原料，加工后的茶葉給人們帶來(lái)很多生理和保健益處，如止渴、消除疲勞、利尿解毒、防止齲齒等作用[3-4]。

貴州位于中國(guó)的西南地區(qū)，處于茶樹(shù)的起源中心地帶，境內(nèi)分布著大量的茶組植物資源，但是因?yàn)殚L(zhǎng)期以來(lái)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的落后以及可利用土地資源的短缺，對(duì)這些豐富茶組植物資源的利用有限。但是，這些尚未開(kāi)發(fā)的茶樹(shù)資源為研究其遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)以及進(jìn)化關(guān)系提供寶貴的資源[5]。特別是習(xí)水大樹(shù)茶種質(zhì)資源，在歷史文化、經(jīng)濟(jì)、科研均具有較高價(jià)值，是貴州北部分布較廣的、較原始的一個(gè)原生種，與茶樹(shù)（Camellia sinensis）在分類(lèi)學(xué)上同屬一個(gè)組中不同的種[6]。多以半野生型和栽培型大樹(shù)茶形式生長(zhǎng)于我省北部山區(qū)，大樹(shù)茶群落目前總體生長(zhǎng)良好，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民采摘大樹(shù)茶原料收獲頗豐的經(jīng)濟(jì)效益，表現(xiàn)出極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力。近年來(lái)，有研究者對(duì)大樹(shù)茶資源類(lèi)型、地理位置分布、管理方式及生態(tài)環(huán)境進(jìn)行描述，并對(duì)其水浸出物、茶多酚、氨基酸、咖啡堿等茶葉內(nèi)合成分及兒茶素組分進(jìn)行檢測(cè)與分析[7]。也有研究者[8]對(duì)大樹(shù)茶資源遺傳多樣性進(jìn)行調(diào)查研究，因?yàn)榇髽?shù)茶資源長(zhǎng)期缺乏人工馴化，其遺傳多樣性要高于人工馴化的栽培型。但是，對(duì)其應(yīng)用還停留在初放的種質(zhì)混制階段，而針對(duì)種質(zhì)個(gè)體特異性系統(tǒng)及加工后品質(zhì)指標(biāo)多樣性評(píng)價(jià)研究還處于初步階段[9]。

為加快大樹(shù)茶資源的開(kāi)發(fā)利用，試驗(yàn)通過(guò)收集習(xí)水的20份大樹(shù)茶單株，分別測(cè)定其6個(gè)品質(zhì)指標(biāo)：水分、游離氨基酸總量、茶多酚、咖啡堿、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）及兒茶素總量，應(yīng)用相關(guān)性分析、主成分分析、逐步回歸分析方法建立加工茶葉綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的回歸模型，探究模型擬合度及回歸模型顯著性，通過(guò)聚類(lèi)分析法對(duì)20份大茶樹(shù)單株進(jìn)行差異性分析和多樣性分析，對(duì)品質(zhì)進(jìn)行初步劃分，分析單株差異對(duì)生化成分的影響，從而對(duì)品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出3個(gè)AAA級(jí)大茶樹(shù)單株。所建模型可應(yīng)用于實(shí)際大茶樹(shù)品質(zhì)評(píng)價(jià)，為篩選具有高品質(zhì)的大茶樹(shù)提供參考和借鑒，為中國(guó)茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集原生于習(xí)水縣境內(nèi)的習(xí)水大樹(shù)茶鮮葉（以單株作為鮮葉供給主體，形成單株制樣；選取單株為對(duì)比個(gè)體，性狀穩(wěn)定；以一芽二葉或同等嫩度的對(duì)夾葉鮮葉為主，占比不小于95%）及其鮮葉原料制成的茶葉產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

鮮葉→攤青（6 h）→殺青（230 ℃，3～4 min）→干燥（烘箱，85 ℃）→生化成分測(cè)定

1.2.2 品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定方法

水分參照GB 5009.3—2016干燥法測(cè)定；游離氨基酸總量參照GB/T 8314—2013茚三酮比色法測(cè)定；茶多酚參照GB/T 8313—2018酒石酸亞鐵比色法測(cè)定；咖啡堿參照GB/T 8313—2018紫外分光光度法測(cè)定；EGCG及兒茶素參照GB/T 8313—2018高效液相色譜法測(cè)定。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇習(xí)水境內(nèi)不同大樹(shù)茶單株的一芽二葉或同等嫩度的鮮葉為原料，經(jīng)過(guò)綠茶制作工藝，經(jīng)過(guò)攤涼、殺青后，直接烘干形成目標(biāo)樣品[10]，處理后測(cè)定其水分、游離氨基酸總量、茶多酚、咖啡堿、EGCG及兒茶素總量等品質(zhì)指標(biāo)，對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析、逐步回歸分析方法建立大樹(shù)茶綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的回歸模型[11]，選擇擬合度較高、回歸模型顯著的品種。通過(guò)聚類(lèi)法對(duì)20份單株品質(zhì)進(jìn)行初步劃分，通過(guò)分析選擇綜合評(píng)分較高的3份單株作為AAA單株。

將水分定為100分，將其權(quán)重系數(shù)設(shè)為20；游離氨基酸總量越高越好，定為100分，設(shè)其權(quán)重系數(shù)設(shè)為15；茶多酚越小越好，茶多酚定為100分，設(shè)其權(quán)重系數(shù)設(shè)為20；咖啡堿值越小越好，定為100分，設(shè)其權(quán)重系數(shù)設(shè)為15；EGCG含量定為100分，設(shè)其權(quán)重系數(shù)設(shè)為15；兒茶素定為100分，設(shè)其權(quán)重系數(shù)設(shè)為15。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），主持成分分析；采用Origin Pro 9.0進(jìn)行聚類(lèi)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種大樹(shù)茶品質(zhì)的分析

由表1和表2可以看出，不同品種大樹(shù)茶的品質(zhì)成分含量差異明顯，其中水分最高是品種2017-15，為10.58%，最低是品種2017-6，為6.69%；品種2017-3的茶多酚含量最高，為27.48%，最低是品種2017-7，為18.64%；游離氨基酸總含量最高是品種2017-5，為4.79%，最低是品種2017-9，為1.56%；咖啡堿含量最高是品種2017-13，為5.51%，最低是品種2017-6，為2.6%；EGCG含量最高是品種2017-3，為11.41%，最低是品種2017-12，為5.45%；兒茶素總含量最高是品種2017-6，為17.62%，最低是品種2017-7，為11.78%。因此，不同品種大樹(shù)茶各品質(zhì)差異明顯。

將不同大樹(shù)茶品種按1.2.1所示的加工流程制作成品茶。測(cè)定并分析不同品種特征指標(biāo)，結(jié)果如表2所示。不同品種的最值差距明顯，方差相對(duì)較高，表明不同大樹(shù)茶加工的品質(zhì)存在較大差異，不同品種各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)影響方向不一致。

表1 不同大樹(shù)茶單株的生化指標(biāo)

表2 不同大樹(shù)茶單株品質(zhì)的描述分析

2.2 不同大樹(shù)茶單株品質(zhì)指標(biāo)的主成分分析

通過(guò)SPSS軟件對(duì)20份大樹(shù)茶單株的6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)相關(guān)分析表明，水分與茶多酚及兒茶素含量存在極顯著的負(fù)相關(guān)，與咖啡堿含量存在正相關(guān)；游離氨基酸總含量與咖啡堿含量存在極顯著正相關(guān)；茶多酚含量與EGCG含量、兒茶素含量存在極顯著正相關(guān)；EGCG與兒茶素存在極顯著正相關(guān)。由于各指標(biāo)間相關(guān)關(guān)系的存在，易造成整體信息發(fā)生重疊，因此，有必要選取具有代表性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，消除變量之間相關(guān)性，降低評(píng)價(jià)負(fù)擔(dān)。

為進(jìn)一步討論不同品種大樹(shù)茶品質(zhì)的貢獻(xiàn)程度，采用因子分析和主成分分析法確定影響的主要因素[13]，為評(píng)價(jià)大樹(shù)茶品質(zhì)提供依據(jù)。對(duì)6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，得出評(píng)價(jià)因子特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率，如表4所示。由于前2個(gè)主成分對(duì)應(yīng)特征值均大于1，對(duì)應(yīng)的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為91.428%，故可選取前2個(gè)主成分，能較全面反映出不同大樹(shù)茶品質(zhì)的主要信息。

表3 不同大樹(shù)茶單株品質(zhì)的相關(guān)性 %

表4 評(píng)價(jià)因子的特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率

2.3 主成分載荷矩陣、載荷圖及特征向量

主成分載荷反映了各指標(biāo)對(duì)主成分的貢獻(xiàn)率的大小[14]，其前2個(gè)主成分載荷矩陣見(jiàn)表5，由表5可知，第一主成分F1主要反映茶多酚（X3）、EGCG含量（X5）、兒茶素總量（X6）；第二主成分F2反映游離氨基酸總量（X2）、咖啡堿含量（X4）和EGCG含量（X5）。

表5 初始因子載荷矩陣及主成分因子的特征向量

為了更直觀地反映不同大樹(shù)茶的品質(zhì)，采用正交旋轉(zhuǎn)法對(duì)大樹(shù)茶品質(zhì)所對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)的主成分因子進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，并計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的特征向量系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)表5的數(shù)據(jù)，建立主成分與不同大樹(shù)茶品質(zhì)指標(biāo)之間的表達(dá)式[15]。

以大樹(shù)茶水分含量（X1）、游離氨基酸總量（X2）、茶多酚含量（X3）、咖啡堿含量（X4）、EGCG含量（X5）及兒茶素總量（X6）為初始自變量，經(jīng)過(guò)主成分分析，最終得出2個(gè)主成分因子的方程表達(dá)式如Z1～Z2所示，這2個(gè)主成分因子將原來(lái)6個(gè)品質(zhì)指標(biāo)作線性變換，重新組合成一組新的互相無(wú)關(guān)的綜合指標(biāo)，消除不同大樹(shù)茶品質(zhì)6個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性，涵蓋大樹(shù)茶品質(zhì)指標(biāo)的大部分信息，可代替6個(gè)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行大樹(shù)茶加工評(píng)價(jià)模型的建立。

2.4 大樹(shù)茶品質(zhì)指標(biāo)歸一化

經(jīng)回歸線性相關(guān)性分析，大樹(shù)茶綜合指標(biāo)Y與大樹(shù)茶水分相關(guān)系數(shù)為0.091；與游離氨基酸的相關(guān)系數(shù)為0.242；與茶多酚相關(guān)系數(shù)為0.395；與咖啡堿相關(guān)系數(shù)為0.454；與EGCG相關(guān)系數(shù)為0.438；與兒茶素相關(guān)系數(shù)為0.399；與主成分因子的方程Z1和Z2的相關(guān)系數(shù)分別為0.966和0.982；綜合指標(biāo)與各項(xiàng)大樹(shù)茶評(píng)價(jià)指標(biāo)在顯著性水平為0.01上正相關(guān)，說(shuō)明利用該方法得到的綜合加工指標(biāo)準(zhǔn)確可靠。

2.5 大樹(shù)茶品質(zhì)評(píng)價(jià)模型建立

以2個(gè)主成分因子Z1和Z2為自變量，歸一化后綜合加工品質(zhì)指標(biāo)Y為因變量，采用逐步回歸分析方法建立多元線性回歸方程。設(shè)置進(jìn)入值為0.05，移出值為0.1，即：如果一個(gè)變量的F值的概率小于0.05，那么這個(gè)變量將被選入回歸方程中；變量的F值的概率大于設(shè)置的剔除值0.1，則變量將從回歸方程中被剔除。由于自變量Z1和Z2與因變量Y的顯著性的概率小于0.05，得到逐步回歸方程[16]。

由模型系數(shù)表（表6）可看出，自變量顯著性水平Sig.=0.000均小于0.05，說(shuō)明自變量對(duì)因變量影響效果顯著，存在顯著線性關(guān)系。

表6 大樹(shù)茶綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)模型系數(shù)

大樹(shù)茶綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)模型[17]的有效性是通過(guò)決定系數(shù)R2和F檢驗(yàn)進(jìn)行判斷的。對(duì)模型進(jìn)行效果匯總：回歸模型的決定系數(shù)R2=0.999，調(diào)整后R2=0.999，隨機(jī)誤差估計(jì)值小，說(shuō)明模型擬合度較高，能滿足實(shí)際需求，使用模型評(píng)價(jià)大樹(shù)茶綜合品質(zhì)有效。將Z1和Z2替換為初始自變量X1～X6，整理得大樹(shù)茶片綜合指標(biāo)與不同品質(zhì)的回歸模型。

2.6 模型驗(yàn)證

分別選取20份大樹(shù)單株茶樣品驗(yàn)證回歸模型效果[18]，將20份單株的6個(gè)初始指標(biāo)數(shù)據(jù)代入大樹(shù)茶綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)模型，得出品質(zhì)綜合指標(biāo)預(yù)測(cè)值，將預(yù)測(cè)值與綜合品質(zhì)指標(biāo)真值進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，得出的真值與預(yù)測(cè)值相關(guān)系數(shù)為0.991，顯著性為0.014小于0.05，即在0.05水平上顯著相關(guān)，說(shuō)明大樹(shù)茶綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)模型能有效地預(yù)測(cè)大樹(shù)茶的品質(zhì)。圖1為驗(yàn)證試驗(yàn)的真值與預(yù)測(cè)值散點(diǎn)圖，樣品點(diǎn)較集中分布在45°線周?chē)?，表明預(yù)測(cè)值接近真值，即通過(guò)測(cè)定不同大樹(shù)茶的水分含量、游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿、EGCG及兒茶素含量，就可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)大樹(shù)茶的綜合品質(zhì)。

2.7 不同大樹(shù)茶單株綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)

對(duì)20份大樹(shù)茶單株綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行排序，結(jié)果如表7所示。

采用K-means聚類(lèi)算法[19-20]對(duì)20份大樹(shù)茶單株綜合指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析，設(shè)置k=3，聚類(lèi)中心沒(méi)有改動(dòng)達(dá)到收斂時(shí)迭代停止，最終迭代次數(shù)為10，將20份單株的綜合品質(zhì)初步劃分AAA、AA、A這3類(lèi)（表8）。

圖1 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)測(cè)值與真值散點(diǎn)圖

表8 20份大樹(shù)茶綜合品質(zhì)指標(biāo)分類(lèi)

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)收集了習(xí)水大樹(shù)茶資源的20份大樹(shù)茶單株進(jìn)行制樣，測(cè)定水分、游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿、EGCG及兒茶素含量6項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)大樹(shù)茶研究原料的6個(gè)主要品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，得出2個(gè)主成分因子，從而消除原料各個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系，降低后期數(shù)據(jù)處理的冗余性；通過(guò)數(shù)據(jù)指標(biāo)歸一化方法[20]將大樹(shù)茶各個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為一組具有代表性的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，并將綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Y與主成分因子（Z1～Z2）進(jìn)行逐步回歸分析，代入初始自變量X1～X6，整理得大樹(shù)茶綜合指標(biāo)與6個(gè)品質(zhì)的回歸模型，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.999[22]，調(diào)整后R2=0.999，隨機(jī)誤差估計(jì)值小，表明該模型可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)未知樣品的大樹(shù)茶加工品質(zhì)；預(yù)測(cè)值與綜合品質(zhì)指標(biāo)真值進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，得出真值與預(yù)測(cè)值相關(guān)系數(shù)為0.991，顯著性為0.014，小于0.05，說(shuō)明回歸模型能有效地預(yù)測(cè)大樹(shù)茶加工后品質(zhì)；應(yīng)用K-means算法對(duì)20份大樹(shù)茶單株的綜合指標(biāo)進(jìn)行初步聚類(lèi)，篩選出3個(gè)AAA大樹(shù)茶單株，與實(shí)際應(yīng)用情況相符。試驗(yàn)建立的大樹(shù)茶品質(zhì)評(píng)價(jià)模型效果顯著，可應(yīng)用于實(shí)際大樹(shù)茶綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)[23]，后期將進(jìn)一步擴(kuò)大建模樣品數(shù)量，探討多樣建模方法，以增強(qiáng)模型的適用性和精確度；此外，大樹(shù)茶油綜合品質(zhì)K-means聚類(lèi)的合理性和科學(xué)性需進(jìn)一步探討，綜合品質(zhì)分類(lèi)依據(jù)及類(lèi)別將今后研究中繼續(xù)完善并驗(yàn)證。