嗜中性粒細胞彈性蛋白酶體外促進嗜中性粒細胞型鼻息肉中MUC5AC合成和釋放①

藺 林 戴 飛 任國強 魏瑾瑾 陳 崢 湯欣玥

(復旦大學附屬華山醫(yī)院北院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 201907)

目前全世界慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)發(fā)病率約為1%～9%，且逐年增長[1]。我國CRS發(fā)病率約為8%，嚴重威脅公眾健康。CRS的主要癥狀為鼻塞、流黏涕或黏膿涕，是病程超過12周的鼻腔、鼻竇黏膜慢性炎癥性疾病[1，2]。按照外表型分類，CRS可分為慢性鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)和慢性鼻竇炎伴有鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)[3]。按照細胞內表型分類，CRS可分為嗜酸性粒細胞型和非嗜酸性粒細胞型(嗜中性粒細胞型)[4]。黏液的過度分泌是CRS的特征之一，但具體機制尚不明確[5]。本文旨在探討人嗜中性粒細胞彈性蛋白酶(human neutrophils elastase，HNE)體外干預對嗜中性粒細胞型鼻息肉(neutrophilic nasal polyps，NNP)上皮中杯狀細胞(goblet cells，GC)合成和黏蛋白(mucin，MUC)5AC釋放的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 正常鼻黏膜組織來源于12 例因鼻塞而行鼻中隔矯正和下鼻甲成形手術患者的下鼻甲，男女各半，年齡19～61歲，平均年齡42.92歲；NNP組織來源于18例(10男8女)就診于我院耳鼻咽喉頭頸外科并行鼻內鏡手術的CRSwNP患者，年齡18～66歲，平均年齡41.56歲。CRSwNP診斷標準參照EPOS2012和中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2018)[1,3]。所有患者術前至少1個月未服用禁用藥物，都接受包括屋塵螨和其他12種常見吸入性過敏原在內的皮膚點刺試驗以評估其特應性狀態(tài)，陽性標準為皮膚表面風團面積>7 mm2(直徑>3 mm)。排除哮喘的依據包括病史、體格檢查和肺功能測試。本研究經我院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.1.2試劑與儀器 嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(eosinophilcation protein，ECP)、髄過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)單克隆抗體(MBS2085906或MBS8559315)、HNE(MBS568799)、MUC5AC ELISA試劑盒(MBS1606592)均購自美國MyBioSource公司；RT-PCR試劑盒(RR066A)購自日本TaKaRa公司；徠卡激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SP5)購自德國Leica公司。

1.2方法

1.2.1分組 標本分為2組：1組用于免疫熒光染色或HE染色，另1組用于體外培養(yǎng)及相應的體外研究。

1.2.2免疫熒光染色 將組織切片與ECP或MPO單克隆抗體室溫下孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min，與結合異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyante，FITC)的二抗室溫黑暗孵育1 h，用含有0.2% Triton X-100的PBS(PBS-T)洗滌2次，以濃度為10 mg/ml的DAPI在室溫下細胞核染色5 min，PBS-T及PBS清洗，防熒光淬滅劑封片，顯微鏡拍照，LCS Lite軟件分析圖片。

1.2.3HE染色 組織切片在二甲苯中脫蠟10 min，梯度濃度乙醇(100%、95%、85%和70%)浸泡，蘇木精染色10 min，沖洗，伊紅染色5 min，梯度濃度乙醇(70%、85%、95%和100%)脫水，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片。GC細胞計數根據每高倍視野(×400)下細胞數目的平均值(3次)，由2位對本項目完全不知情的研究者進行評估。

1.2.4器官培養(yǎng) 參考文獻[6]將正常鼻黏膜組織和NNP組織進行體外器官培養(yǎng)，無菌條件下分割為2～3 mm3組織塊，用含有5 μg/ml兩性霉素B和300 μg/ml 青霉素G的PBS洗3次，以含有10%小牛血清和20 μg/ml慶大霉素的98%DMEM再清洗，加入600 μg/ml HNE孵育1 h，將組織塊放于1×1 cm 大小的濕明膠海綿，黏膜面或息肉面朝上，明膠海綿放于含有3 ml培養(yǎng)液的6孔板，黏膜或息肉高于液面，37℃、5%CO2孵育，連續(xù)轉動24 h(15 r/min)，收集組織塊進行后續(xù)試驗(圖1)。

1.2.5ELISA檢測MUC5AC蛋白水平 將正常鼻黏膜組織和NNP組織塊再次分割，RIPA裂解液分解，MUC5AC ELISA試劑盒檢測組織MUC5AC蛋白含量，嚴格按照說明書操作。

1.2.6RT-PCR檢測正常鼻黏膜組織和NNP組織中的MUC5AC mRNA MUC5AC引物由上海捷蘭生物技術有限公司設計，F：5′-TGATCATCCAGCAGCAG-GGCT-3′，R：5′-CCGAGCTCAGAGGACATATGGG-3′；內參β-actin F：5′-CACTCTTCCAGCCTTCCTTC-3′，R：5′-GTACAGGTCTTTGCGGATGT-3′，按照RT-PCR試劑盒說明書檢測，2-ΔΔCt法計算。

1.3統(tǒng)計學分析 GraphPad Prism6軟件分析數據，數據呈非正態(tài)分布，采用非參數檢驗法進行分析。如果組間Kruskal-Wallis檢驗差異有統(tǒng)計學意義，則用Mann-Whitney檢驗進一步分析數據，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1臨床病理分析 本研究收集的NNP病例中男性多于女性，且均為非特應性體質(至少對包括屋塵螨在內的13項常見過敏原進行檢測)，說明NNP組織以Ⅰ 型炎癥反應為主。近期未局部應用或口服激素、抗組胺藥或抗菌藥，說明該息肉組織受外界影響較小，可以反映自然狀態(tài)下的NNP發(fā)病特點，見表1。

2.2檢測NNP中嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞浸潤情況 所有正常鼻黏膜組織標本中幾乎未出現炎癥細胞，所有NNP標本中出現2種炎癥細胞，但嗜酸性粒細胞數量均 <10個/高倍視野，而中性粒細胞數均 >10個/高倍視野，因此本研究中息肉組織均屬于NNP，見圖1。

2.3正常鼻黏膜組織和NNP組織干預前后GC數目和炎癥細胞浸潤情況 NNP中GC計數多于正常黏膜組織(P<0.000 1)，HNE作用后，GC顯著增生或由纖毛上皮化生，GC數目顯著高于NNP組織(P<0.000 1)，NNP組織在HNE干預前后炎癥細胞數均多于正常組織，見圖2。

2.4HNE對NNP中GC合成和釋放MUC5AC的影響 NNP組MUC5AC蛋白及mRNA含量顯著高于正常鼻黏膜組(P<0.000 1)，經HNE體外干預后，MUC5AC蛋白及mRNA表達進一步升高，即HNE干預組MUCAC蛋白及mRNA水平顯著高于NNP組(P<0.000 1)，見圖3。

表1 臨床病理資料

圖1 正常鼻黏膜和NP組織的免疫熒光染色(×400)Fig.1 Immuofluorescent staining of normal nasal mucosa and NP tissues(×400)Note:A，B，C，D.Normal nasal mucosa tissues;E，F，G，H.NP tissues.

圖2 正常鼻黏膜和NP組織HE染色(×400)Fig.2 HE staining of normal nasal mucosa and NP tissues(×400)Note:A.Normal nasal mucosa tissue;B.Nasal polyp tissue;C.Nasal polyp tissue after treatment of HNE；****.P<0.000 1.

圖3 正常鼻黏膜、NP組織、HNE干預后NP組織中MUC5AC水平比較Fig.3 Comparisons of MUC5AC levels among normal nasal mucosa，NP and NP tissues after treatment of HNENote:****.P<0.000 1.

3 討論

黏蛋白是上呼吸道黏液性分泌物的主要成分，與水、離子、抗菌物質、抗氧化分子和抑制性蛋白酶類等及上皮纖毛共同組成黏液纖毛清除系統(tǒng)，是抵抗吸入性抗原物質的第一道防線[7]。但黏液分泌亢進會導致CRS患者發(fā)病時黏涕或黏膿涕大量外溢，或經前鼻孔流出或形成鼻后滴漏，影響患者生活質量[1]。黏蛋白包括分泌性黏蛋白及結構性黏蛋白，前者主要包括MUC5AC和MUC5B，MUC5AC主要由GC合成和釋放，MUC5B主要由黏膜下腺體產生和分泌，對呼吸道黏液纖毛清除功能起重要作用，后者主要包括跨膜糖蛋白，位于呼吸道上皮表面，黏附吸入性抗原，調控轉錄因子表達，參與固有免疫、細胞分化和增殖[8,9]。黏蛋白表達和功能異常會導致黏液清除系統(tǒng)失效、固有免疫障礙和氣道重構等，最終誘發(fā)上下呼吸道疾病，如囊性纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺病，甚至惡性腫瘤等[10,11]。黏蛋白的表達特點與CRS發(fā)病機制的關系鮮有報道，且尚無證據表明黏蛋白的異常表達與NP的發(fā)生發(fā)展相關。研究表明，與CRSsNP相比，MUC5AC或MUC5B在CRSwNP患者的息肉組織中表達提高，但具體機制尚不明確，可能與局部的轉錄因子或細胞因子濃度上調有關[12-15]。因此，本研究探討HNE體外干預對NNP上皮中GC合成和釋放MUC5AC的影響。

研究證實，亞裔CRSwNP患者的NP組織中嗜酸性粒細胞無明顯增多，伴隨著相應Ⅱ型細胞因子及炎癥介質減少，同時出現Ⅰ型偏向的炎癥反應特點，并伴隨嗜中性粒細胞浸潤增多[16]。本研究納入的NP患者經免疫熒光染色鑒定均為NNP類型。將正常鼻黏膜與NP組織在體外進行器官培養(yǎng)，將組織放置于空氣和培養(yǎng)液交界處，模擬鼻腔和鼻竇生理病理環(huán)境下黏膜和息肉組織的存活狀態(tài)，可較好地反映組織真實生理病理情況[6]。

本研究表明，NNP中GC多于正常黏膜組織，說明NP組織上皮中GC出現增生或由纖毛上皮化生[17]。HNE干預后，GC進一步出現增生或化生，顯微鏡下計數結果表明，NNP組織中GC計數顯著多于正常黏膜，HNE的作用促進GC數目繼續(xù)增多，說明該蛋白酶可直接或間接作用于黏膜上皮，導致GC增殖，但機制有待進一步研究。NNP組織在HNE干預前后炎癥細胞均多于正常組織，由于計數誤差和NP組織中炎癥狀態(tài)情況，本研究未對上述組織中的炎癥細胞進一步定量分析。為進一步確定體外HNE干預對NNP中GC合成和釋放MUC5AC的影響，本研究將對象分成正常鼻黏膜組、NNP組和HNE干預組，并用ELISA和實時定量RT-PCR法對各組培養(yǎng)基中MUC5AC蛋白及其mRNA的濃度進行檢測。結果顯示，NNP組中MUC5AC蛋白及mRNA含量顯著高于正常鼻黏膜組，說明息肉發(fā)生、發(fā)展過程中，黏蛋白MUC5AC在GC中的合成和釋放均有增加，經HNE干預后該蛋白及mRNA表達進一步升高，說明NNP發(fā)病機制中，嗜中性粒細胞釋放的HNE可促進上皮中GC的增生或化生，上調GC中MUC5AC合成和分泌。本研究側面證實了嗜中性粒細胞在NP病理生理機制中可能的作用機制。