利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Fbxw7敲低的Raw264.7穩(wěn)定細(xì)胞株及其生理功能檢測(cè)①

宋璟瑞 周 爽 聞 馨 陳云飛 萬(wàn) 梅 羅梁杰 杜德兵 王德成

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，三峽大學(xué)感染與炎癥損傷研究所，宜昌 443002)

Fbxw7(F-box and WD repeat domain containing 7)，是SCF型(Skp1-Cullin-F-box protein)泛素連接酶E3的底物識(shí)別蛋白[1,2]。Fbxw7 能夠通過(guò)特異性識(shí)別并結(jié)合底物蛋白，從而使目的蛋白通過(guò)泛素蛋白酶系統(tǒng)降解。大量研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)bxw7 不僅靶向泛素化降解多種參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白分子，如Notch、Myc、Jun、Cyclin E，還在脂類代謝，細(xì)胞增殖和分化，維持干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[1,3-5]。同時(shí)，最新研究證實(shí)RNA病毒感染過(guò)程中，E3泛素連接酶Fbxw7通過(guò)保持維甲酸誘導(dǎo)Ⅰ型基因(retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的穩(wěn)定性，正向調(diào)控Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，最終促進(jìn)機(jī)體抗RNA病毒的天然免疫應(yīng)答[6]。

Fbxw7表達(dá)量的改變會(huì)導(dǎo)致下游底物發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),并在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色[7]。目前關(guān)于Fbxw7參與疾病的發(fā)生與發(fā)展的具體機(jī)制尚不完全清楚[7-9]。但有研究結(jié)果證實(shí)Fbxw7基因敲除小鼠會(huì)導(dǎo)致發(fā)育缺陷和胚胎致死[10]。所以通過(guò)建立過(guò)表達(dá)或者低表達(dá)Fbxw7的穩(wěn)定細(xì)胞系，可為進(jìn)一步研究Fbxw7的功能與作用機(jī)制提供新的平臺(tái)。本研究利用近年來(lái)在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的成簇的有規(guī)律間隔織的短回文重復(fù)序列CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/Cas9) 技術(shù)成功構(gòu)建了Raw264.7巨噬細(xì)胞中Fbxw7基因敲低穩(wěn)定細(xì)胞株,并檢測(cè)Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Raw264.7細(xì)胞中Fbxw7的mRNA和蛋白表達(dá)變化，最后從細(xì)胞增殖、凋亡等方面初步探索Fbxw7在Raw264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)分化中的作用,為深入研究Fbxw7在巨噬細(xì)胞中的功能和機(jī)制提供相應(yīng)理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 Raw264.7(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)與293ft(人胚腎細(xì)胞)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。Control CRISPR/Cas9質(zhì)粒、Fbxw7_CRISPR/Cas9KO 及其HDR質(zhì)粒，質(zhì)粒專用培養(yǎng)基均購(gòu)自Santa Cruz公司。Thermo Turbofect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自ThermoFisher Scientific。嘌呤霉素培養(yǎng)基購(gòu)自Solarbio公司。胰酶消化液(Gelife Science)。引物由AuGCT DNA-SYN合成。Anti-Fbxw7抗體(ab109617)購(gòu)自Abcam公司。β-actin抗體、HRP-羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自博士德生物有限公司。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量SYBR染料試劑盒購(gòu)自Vazyme Biotech。Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG、DAPI、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。CCK-8試劑盒均購(gòu)自博士德生物有限公司。凋亡試劑盒均購(gòu)自BD生物公司。

1.2方法

1.2.1Cas9轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化 ①為優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑Turbofect與Cas9 質(zhì)粒的最佳比例，分別以不同體積/濃度比(5 μl∶1 μg；10 μl∶1 μg；15 μl∶1 μg)將Turbofect與Control Cas9 質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。②在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)接種2×105個(gè)293FT細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。③分別將不同濃度的轉(zhuǎn)染試劑稀釋到質(zhì)粒專用培養(yǎng)基中，最終體積為150 μl，混勻后室溫靜置5 min；質(zhì)粒DNA稀釋到質(zhì)粒專用培養(yǎng)基中，最終體積達(dá)到150 μl，混勻后室溫靜置5 min。④將質(zhì)粒DNA溶液直接滴加稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑的試管中，立即漩渦混勻，并在室溫靜置20 min以上。⑤轉(zhuǎn)染之前，用新鮮無(wú)抗生素培養(yǎng)基更換6孔板的培養(yǎng)液，質(zhì)粒DNA/添加轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物逐滴到培養(yǎng)板中。⑥轉(zhuǎn)染后24 h內(nèi)無(wú)需更換培養(yǎng)基。⑦轉(zhuǎn)染48 h后通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)紅色熒光蛋白(red fluorescence protein,RFP)觀察，確認(rèn)Control Cas9 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2Fbxw7_Cas9 KO質(zhì)粒和Fbxw7 _HDR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至Raw264.7細(xì)胞 ①在6孔培養(yǎng)板(Corning)接種2×105個(gè)Raw264.7細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。②按照轉(zhuǎn)染試劑體積與Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒的最佳比例10 μl∶1 μg轉(zhuǎn)染。③Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒和Fbxw7_HDR質(zhì)粒稀釋到質(zhì)粒專用培養(yǎng)基，最終體積達(dá)到150 μl，混勻，室溫靜置5 min。20 μl轉(zhuǎn)染試劑稀釋到質(zhì)粒專用培養(yǎng)基，最終體積達(dá)到150 μl混勻，室溫靜置5 min。④將Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒溶液直接滴加稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑的試管中，立即漩渦并在室溫靜置20 min以上。⑤轉(zhuǎn)染之前，用新鮮無(wú)抗生素的培養(yǎng)基更換6孔板的培養(yǎng)液，300 μl質(zhì)粒DNA/添加轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合劑逐滴到培養(yǎng)板中。⑥轉(zhuǎn)染24 h之后，根據(jù)其需要更換培養(yǎng)基。⑦通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)RFP表達(dá)，以確認(rèn)Fbxw7Cas9 KO質(zhì)粒和Fbxw7 HDR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染成功。

表1 實(shí)時(shí)定量熒光PCR引物序列

1.2.3嘌呤霉素篩選Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒和Fbxw7_HDR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染成功的Raw264.7 ①經(jīng)過(guò)篩選Raw264.7中使用嘌呤霉素最佳濃度為1 μg/ml。②使用含嘌呤霉素含血清的選擇性培養(yǎng)基，在7 d內(nèi)選擇殺死100%未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。③轉(zhuǎn)染48 h后，吸出培養(yǎng)基并用含有適當(dāng)濃度的嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基將其替換。④嘌呤霉素培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7 d。大約每2 d，用新鮮選擇性培養(yǎng)基吸出并替換。

1.2.4挑選Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞 ①通過(guò)胰蛋白酶消化分離細(xì)胞，并通過(guò)0.4 μm細(xì)胞濾網(wǎng)將細(xì)胞團(tuán)破碎成單個(gè)細(xì)胞。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器定量測(cè)量勻漿細(xì)胞溶液中的細(xì)胞濃度。②將細(xì)胞從均質(zhì)化的細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至條件培養(yǎng)基中，用新鮮的完全培養(yǎng)基制成5個(gè)/ml的新細(xì)胞溶液，播種到96孔板每孔約10 μl該細(xì)胞溶液。④將生長(zhǎng)成細(xì)胞集落的細(xì)胞用胰酶消化后傳代，培養(yǎng)后凍存。

1.2.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Fbxw7的mRNA表達(dá)水平 ①將正常Raw264.7細(xì)胞和Fbxw7突變的Raw264.7細(xì)胞鋪于6孔板。②Trizol法提取總RNA。首先用Trizol試劑裂解細(xì)胞，靜置5 min離心，取上清液再加入等量氯仿，充分振蕩后冰上靜置5 min，離心后加等量的異丙醇，冰上靜置20 min后，離心棄上清，加70%無(wú)水乙醇洗滌沉淀，離心棄上清后加入DEPC水20 μl。③RNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后生成單鏈cDNA。④SYBR Green master Rox用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6Western blot檢測(cè)Fbxw7蛋白表達(dá)變化

(1)提取正常Raw264.7細(xì)胞和Fbxw7突變的Raw264.7細(xì)胞的總蛋白：① 用PBS收取細(xì)胞，低速離心細(xì)胞獲得細(xì)胞沉淀，用RIPA 100 μl裂解細(xì)胞，冰上靜置50 min，離心取上清液。② 使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒定量，將96孔板置于37℃恒溫孵育箱中孵育30 min，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在562 nm處測(cè)量每孔OD值，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本蛋白質(zhì)濃度。③ 20 μg蛋白置于1.5 ml EP管中，加入1/5總體積的5×SDS上樣緩沖液，100℃沸水浴煮10 min 滅活蛋白，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)Western blot實(shí)驗(yàn)過(guò)程：10%SDS濃縮膠電泳；使用PVDF膜，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h；10%牛奶封閉1.5 h；一抗孵育過(guò)夜；二抗孵育1 h；ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影，使用Image J軟件分析目的蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7測(cè)序分析基因突變位點(diǎn) ①提取正常Raw264.7細(xì)胞和Fbxw7突變的Raw264.7細(xì)胞的基因組DNA。② PCR擴(kuò)增體系如下：2×SYBR Green Taq Mix 12.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 10.5 μl，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性25 min,95℃變性10 s;54℃退火30 s;72℃延伸40 s;35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min。③ PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)確定有目標(biāo)條帶后，回收凝膠純化后送于測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析。④測(cè)序結(jié)果采用SnapGene軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析突變位點(diǎn)。

1.2.8Confocal熒光顯微鏡觀察Fbxw7表達(dá) ①將5×105個(gè)的正常Raw264.7細(xì)胞和Fbxw7突變的Raw264.7細(xì)胞分別鋪在6孔板的玻璃蓋玻片上。② 將細(xì)胞在4℃下用2%多聚甲醛固定30 min，用0.1%Triton X-100透化，用PBS中的1%BSA封閉1 h，并用兔抗Fbxw7抗體孵育過(guò)夜，染色的FITC標(biāo)記的抗兔第二抗體，以檢測(cè)Fbxw7表達(dá)位置。用DAPI對(duì)細(xì)胞核染色。③ 用Leica TCS SP2共聚焦激光顯微鏡檢測(cè)表達(dá)位置變化，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.9細(xì)胞活力測(cè)定 ①用正常Raw264.7細(xì)胞和Fbxw7突變的Raw264.7細(xì)胞鋪在96孔板上。② 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，96孔板每孔加入100 μl對(duì)數(shù)期細(xì)胞，使待測(cè)細(xì)胞密度至1×103～1×104個(gè)/孔；5%CO2、37℃培養(yǎng)箱里孵育24 h。③ 每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細(xì)胞孵育箱繼續(xù)孵育2 h。④ 使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.10流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率 ①用正常Raw264.7細(xì)胞和Fbxw7突變的Raw264.7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集各孔上清液于離心管中備用。② 將各組細(xì)胞用 PBS清洗2次,胰酶消化后與上述上清液共同制成單細(xì)胞懸液。③ 離心后，去上清用100 μl的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl 7-AAD和2.5 μl PE溶液混勻,室溫避光孵育 15 min。④ 加入 400 μl的2×Binding Buffer混勻。⑤ 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1CRISPR/Cas9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染最佳效率 不同條件轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡觀察不同視野下RFP表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Turbofect與Control CRISPR/Cas9為10 μl∶1 μg時(shí)RFP表達(dá)最強(qiáng)，表明10 μl∶1 μg為本實(shí)驗(yàn)中Cas9質(zhì)粒最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件，見(jiàn)圖1。

2.2Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒 和Fbxw7_HDR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染效率鑒定 確定Turbofect與Cas9質(zhì)粒的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件后，將Fbxw7_Cas9 KO和Fbxw7_HDR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至Raw264.7巨噬細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h時(shí)用倒置熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有RFP的表達(dá)與分布，見(jiàn)圖2。

2.3Fbxw7 _ Cas9KO轉(zhuǎn)染成功后的單克隆挑選及Fbxw7表達(dá)檢測(cè) Quantitative Real-time PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Fbxw7敲低組的Raw264.7細(xì)胞的Fbxw7 mRNA表達(dá)明顯下降 (P<0.05,圖3A)。Western blot檢測(cè)Fbxw7蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與正常Raw264.7細(xì)胞相比，F(xiàn)bxw7敲低組Raw264.7細(xì)胞的Fbxw7蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01,圖3B、C)。證實(shí)Raw264.7細(xì)胞的Fbxw7基因已成功被敲低。

2.4基因測(cè)序分析 測(cè)序結(jié)果(圖4B)與原序列進(jìn)

圖1 Turbofect 與Control CRISPR/Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率 (W：白光；RFP:紅光)Fig.1 Optimal efficiency between Turbofect and Control CRISPR/Cas9 plasmid (W:white light channel;RFP:red light channel)

圖2 Fbxw7-Cas9KO轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞后48 h后RFP檢測(cè)Fig.2 Detection of RFP of Raw264.7 cells after 48 h transferred with Fbxw7-Cas9KO plasmid

行對(duì)比(圖4A),結(jié)果顯示，圖4B紅色框所示原序列與Fbxw7敲低組相比，敲低Fbxw7后的細(xì)胞存在多個(gè)位點(diǎn)的堿基突變和缺失。

2.5Confocal顯微鏡觀察比較Fbxw7蛋白表達(dá)情況 激光共焦距顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)正常Raw264.7細(xì)胞中可檢測(cè)到明顯的Fbxw7蛋白表達(dá)，且Fbxw7主要分布在細(xì)胞核；而Fbxw7敲低組Raw264.7中Fbxw7蛋白表達(dá)顯著降低，見(jiàn)圖5。

圖3 Fbxw7 Cas9KO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Raw264.7細(xì)胞中Fbxw7的表達(dá)Fig.3 Expressions of Fbxw7 in Raw264.7 cell after Fbxw7 Cas9KO plasmid transinfectedNote:*.P<0.05；**.P<0.01.

圖4 Fbxw7敲低的細(xì)胞與正常Raw264.7細(xì)胞基因測(cè)序結(jié)果Fig.4 Comparison of sequencing data of Fbxw7 gene in normal and Fbxw7-knockdown Raw264.7 cells Note:A.Fbxw7 gene sequencing results for normal Raw264.7 cells；B.Fbxw7 gene sequencing results for knocked down in Raw264.7 cells.

圖5 Confocal觀察Fbxw7蛋白的表達(dá)變化Fig.5 Examination of expression of Fbxw7 protein with Confocal microscope

圖6 敲低Fbxw7后Raw264.7的細(xì)胞增殖能力分析Fig.6 Raw264.7 cell viability was decreased after Fbxw7 knockdownNote:*.P<0.05；**.P<0.01.

2.6Fbxw7對(duì)Raw264.7細(xì)胞增殖能力的影響 與對(duì)照組相比，敲低Fbxw7的Raw264.7的細(xì)胞增殖能力明顯下降，并且與正常Raw264.7細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖6。

2.7Fbxw7對(duì)Raw264.7細(xì)胞凋亡能力的影響 流式細(xì)胞術(shù)及AnnexinV-FITC/PI染色法檢測(cè)Raw264.7細(xì)胞24 h內(nèi)凋亡情況。結(jié)果顯示,與對(duì)照Raw264.7細(xì)胞組相比,Fbxw7基因敲低組的Raw264.7細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

圖7 敲低Fbxw7后Raw264.7細(xì)胞的凋亡能力分析Fig.7 Apoptosis assay of Raw264.7 cells after Fbxw7 knockdownNote:*.P<0.05.

3 討論

Fbxw7是重要的E3連接酶之一，在過(guò)去的十年中，大量研究已證實(shí)，E3連接酶Fbxw7在腫瘤發(fā)生和發(fā)展、細(xì)胞增殖、分化和血管生成中起著關(guān)鍵作用[1,3-5,11]。Fbxw7通過(guò)識(shí)別和作用于多個(gè)底物分子如c-Myc，cyclin E和MCL-1等參與細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[4]。Fbxw7作為腫瘤抑制因子，可調(diào)控致癌基因的表達(dá)水平，因此近年來(lái)越來(lái)越多的研究將Fbxw7作為腫瘤預(yù)后指標(biāo)，視為腫瘤治療的潛在靶標(biāo)[11-13]。研究證實(shí)缺失Fbxw7會(huì)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展并導(dǎo)致吉非替尼耐藥性[14]；骨髓細(xì)胞中缺乏Fbxw7會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少，促進(jìn)自身抗體產(chǎn)生和引起腎小球腎炎等[13]；Fbxw7基因的靶向失活還會(huì)導(dǎo)致妊娠中期胚胎的高致死率和嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲緩[10,13,15]。不僅如此，F(xiàn)bxw7在抗病毒免疫中也發(fā)揮重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)組織特異性敲除的Fbxw7小鼠顯示出對(duì)RNA病毒感染的高敏感性，并且病毒復(fù)制顯著增強(qiáng)，該研究為Fbxw7在抗病毒免疫中的功能及其相關(guān)的臨床意義提供了依據(jù)[15]?？傊?，F(xiàn)BXW7在眾多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

近年來(lái)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于各種基因功能的研究。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種在gRNA的指導(dǎo)下，在基因組水平上對(duì)目的基因DNA序列進(jìn)行改造的定點(diǎn)編輯技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定[16,17]。目前已有文獻(xiàn)指出，使用CRISPR/Cas9技術(shù)可以突變Raw264.7中的內(nèi)源性miR-155基因，并獲得了miR-155基因組敲除克隆[18]。以上研究結(jié)果為利用CRISPR/Cas9技術(shù)突變Raw264.7中的相關(guān)靶基因及進(jìn)一步研究這些基因的功能提供了理論基礎(chǔ)與技術(shù)手段。

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在一定的脫靶率[19]。為了減少脫靶效應(yīng)，本研究選擇了Fbxw7_Cas9KO質(zhì)粒和Fbxw7_HDR質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，F(xiàn)bxw7_HDR質(zhì)粒的設(shè)計(jì)是通過(guò)非同源端連接(NHEJ)或同源定位(HDR)途徑，修復(fù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中產(chǎn)生的含有雙鏈斷裂(DSB)的DNA，從而達(dá)到敲低Fbxw7基因的目的。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)Fbxw7基因在Raw264.7細(xì)胞穩(wěn)定低表達(dá),所篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株可用于后續(xù)細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Fbxw7敲低的Raw264.7穩(wěn)定細(xì)胞株，并對(duì)敲低Fbxw7后Raw264.7細(xì)胞增殖及凋亡的變化做了進(jìn)一步探索，發(fā)現(xiàn)敲低Fbxw7后Raw264.7的增殖能力明顯下降，并且這種下降趨勢(shì)可能是Fbxw7表達(dá)降低后促進(jìn)其凋亡導(dǎo)致，這為深入研究Fbxw7在巨噬細(xì)胞中的功能和作用機(jī)制提供新的線索與工作基礎(chǔ)。