LncRNA CCAT1在子宮內(nèi)膜癌組織的表達(dá)意義以及雷公藤甲素的干預(yù)作用①

李 林 魏旭靜 代麗麗 路素雙 劉 晶

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050000)

子宮內(nèi)膜癌是一種原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位于首位[1]。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(colon cancer-associated transcriptome 1,CCAT1)是結(jié)直腸癌組織中新近發(fā)現(xiàn)的一種異常高表達(dá)的長鏈非編碼RNA(LncRNA)，相關(guān)研究表明：LncRNA CCAT1與卵巢癌、肝癌和胃癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2-4]。CCAT1通過內(nèi)源競爭等機(jī)制與微小RNA或蛋白相互作用，參與調(diào)控機(jī)體生理病理過程，其在腫瘤組織中表達(dá)水平升高，會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等作用[5]。目前對早期子宮內(nèi)膜癌的治療以手術(shù)治療為主，晚期子宮內(nèi)膜癌的治療以化療為主，但化療容易產(chǎn)生惡心嘔吐、免疫功能紊亂、肝腎功能損傷等方面的毒副作用[6]。雷公藤甲素是衛(wèi)矛科植物雷公藤中主要有效成分之一，具有免疫抑制、抗炎等藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)：雷公藤甲素對胃癌、卵巢癌和宮頸癌等具有一定的抑制作用[7-9]。目前尚未發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌抑制作用的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過制備子宮內(nèi)膜癌荷瘤小鼠模型，給予不同劑量雷公藤甲素干預(yù)，觀察其對小鼠移植瘤生長以及子宮內(nèi)膜癌組織中LncRNA CCAT1和caspase-3表達(dá)的影響，探討其干預(yù)作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6小鼠50只，雌性，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：SYXK(冀)2018-008，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度(24±4)℃，濕度(55±5)%。子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1.0×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)，于37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×107個(gè)/ml。雷公藤甲素購自中科院上海藥物研究所。caspase-3單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。LncRNA-CCAT1序列由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立及分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞，勻漿處理，調(diào)整至細(xì)胞濃度1×106個(gè)/ml。取0.2 ml 接種于小鼠右腋外側(cè)皮下，每d觀察接種部位成瘤情況，約接種6 d后，以移植瘤達(dá)到5 mm×5 mm 為成瘤標(biāo)準(zhǔn)[10]。取達(dá)標(biāo)小鼠40只，隨機(jī)分為模型組、低、中和高劑量雷公藤甲素組，低、中和高劑量雷公藤甲素組分別腹腔注射25、50、100 μg/kg的雷公藤甲素，1次/d，連續(xù)給藥15 d，另取10只未造模小鼠作為對照組，腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2測定瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率 各組小鼠給藥15 d后禁食不禁水12 h，處死小鼠，取瘤組織，稱重，測定抑瘤率，公式如下：抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量-雷公藤甲素組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.3HE染色觀察組織形態(tài) 取移植瘤組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，不同濃度乙醇脫水，透明處理，石蠟包埋，切成厚度為4 μm的組織切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4TUNEL染色計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic-index,AI) 取移植瘤組織石蠟切片，脫蠟，水化后按TUNEL試劑盒說明書處理，光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核染黃為凋亡細(xì)胞。每張切片選取6個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，取平均值，計(jì)算AI，公式如下：AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.5免疫組織化學(xué)法檢測子宮內(nèi)膜癌組織中caspase-3蛋白表達(dá) 取移植瘤組織石蠟切片，脫蠟，水化，加入血清封閉10 min，加入caspase-3單克隆抗體，4℃放置過夜，滴加生物素化羊抗兔IgG及SAB復(fù)合液，DAB染色、蘇木精復(fù)染，封片。以細(xì)胞呈棕褐色為蛋白表達(dá)陽性標(biāo)準(zhǔn)，每張切片選取6個(gè)視野，測定每個(gè)視野的平均吸光度值，為caspase-3蛋白表達(dá)密度。

1.2.6qPCR法檢測LncRNA-CCAT1 mRNA表達(dá) 取移植瘤組織，采用Trizol法提取組織總RNA，采用紫外分光光度計(jì)于280 nm波長下檢測總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，PCR擴(kuò)增儀檢測LncRNA-CCAT1 mRNA表達(dá)水平。通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，CCAT1引物序列：上游5′-CCAATTGAACCGAGCCTTGT-3′；下游5′-TCGTGAGCG-TTTTCGCAATG-3′，長度298 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游5′-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′，長度176 bp。PCR擴(kuò)增體系為10 μl，反應(yīng)條件：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示LncRNA-CCAT1 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1雷公藤甲素對抑瘤率的影響 與模型組比較，對照組、低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠移植瘤瘤質(zhì)量明顯減少(P<0.05)。高劑量雷公藤甲素組抑瘤率明顯高于低和中劑量雷公藤甲素組(P<0.05)。見表1。

2.2各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)觀察 模型組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織血管豐富，腫瘤細(xì)胞大小、外形不一致，生長密集，排列不規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)不一致，出現(xiàn)病理性核分裂像。低、中、高劑量雷公藤甲素組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)血管減少，結(jié)構(gòu)破壞，松散，腫瘤細(xì)胞散在，出現(xiàn)不同程度壞死，細(xì)胞核碎裂，伴隨劑量升高組織壞死面積增大。見圖1。

2.3雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌組織凋亡情況的影響 與模型組比較，低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增加，AI均明顯升高(P<0.05)；與低劑量雷公藤甲素組比較，中和高劑量雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增加，AI均明顯升高(P<0.05)；與中劑量雷公藤甲素組比較，高劑量雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，AI明顯升高(P<0.05)。見圖2和表2。

2.4雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌組織caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中caspase-3蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，A值均明顯上升(P<0.05)；與低劑量雷公藤甲素組比較，中和高劑量雷公藤甲素組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中caspase-3蛋白A值均明顯升高(P<0.05)；與中劑量雷公藤甲素組比較，高劑量雷公藤甲素組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中caspase-3蛋白A值明顯增加(P<0.05)，其表達(dá)水平呈劑量依賴性。見圖3、表3。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、移植瘤質(zhì)量和抑瘤率比較

圖1 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織HE染色圖(×400)Fig.1 HE staining of endometrial carcinoma tissues of mice in various groups(×400)Note:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

2.5雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA-CCAT1 mRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA-CCAT1 mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中和高劑量雷公藤甲素組大鼠子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA-CCAT1 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

圖2 各組小鼠移植瘤細(xì)胞凋亡情況(×400)Fig.2 Apoptosis of transplanted tumor cells in various groups(×400)Note:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

表2 各組小鼠移植瘤AI比較

圖3 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織免疫組織化學(xué)圖(×400)Fig.3 Immunohistochemistry of endometrial carcinoma tissues of mice in various groups(×400)Note:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

表3 各組小鼠移植瘤組織caspase-3蛋白A值比較

表4 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA-CCAT1 mRNA表達(dá)水平

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重危害女性的生殖健康。目前臨床上對子宮內(nèi)膜癌的治療主要采取手術(shù)物理切除和化療等方法，但復(fù)發(fā)率高，副作用大。如何有效抑制子宮內(nèi)膜癌組織惡化一直是臨床腫瘤醫(yī)學(xué)的難題。雷公藤甲素是中藥雷公藤的有效成分，屬于環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，其活性是雷公藤總苷的100倍，抗癌能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紫杉醇、絲裂霉素和阿霉素[11-14]。研究表明：雷公藤甲素對多種癌癥細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移有一定的抑制作用[15]。本研究結(jié)果表明，低、中和高劑量的雷公藤甲素均能明顯減輕荷瘤小鼠移植瘤質(zhì)量，明顯提高抑瘤率，說明不同劑量的雷公藤甲素對腫瘤生長有明顯的抑制作用。凋亡作為一種細(xì)胞選擇進(jìn)化性的程序性死亡，參與細(xì)胞死亡的過程，有助于機(jī)體及時(shí)降解、消滅對整個(gè)機(jī)體造成危險(xiǎn)的細(xì)胞，以及保證各種類型細(xì)胞之間的穩(wěn)態(tài)環(huán)境。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，低、中和高劑量的雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增加；腫瘤組織caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高，caspase-3參與細(xì)胞凋亡啟動(dòng)和整個(gè)凋亡過程的調(diào)控，以上結(jié)果均說明雷公藤甲素具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用[16，17]。

CCAT1是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種具有促癌作用的LncRNA，在多種腫瘤中異常高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18-20]。LncRNA CCAT1過表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，此外，通過競爭性結(jié)合微小RNA從而升高其靶基因Biml的表達(dá)水平，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞增殖和侵襲能力。本研究結(jié)果表明，低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織中LncRNA CCAT1表達(dá)水平均明顯降低，說明其在腫瘤組織中表達(dá)水平的高低與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，與研究報(bào)道一致，LncRNA CCAT1極有可能成為判斷癌癥發(fā)展程度的腫瘤標(biāo)志物[21]。

綜上所述，雷公藤甲素對荷子宮內(nèi)膜癌小鼠移植瘤生長有一定抑制作用，其作用機(jī)制可能與降低LncRNA-CCAT1表達(dá)，下調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。